多種Gq蛋白偶聯(lián)受體激活后對KCNQ-M電流的作用及機制的研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled-receptors，GPCRs)是目前發(fā)現(xiàn)的最大的細胞膜表面受體超家族，具有重要的生理病理學和藥理學意義。其獨特的結構特征和在信號轉導中的重要作用決定了其可以作為很好的藥物靶點。GPCRs特異性的激動劑及阻斷劑具有良好的藥物開發(fā)前景。事實上目前市場上超過一半的藥物均是以GPCRs為靶點的。不同的GPCR通過和相應的G蛋白(G protein)偶聯(lián)可以對細胞外多種刺激信號作出反應，在細胞

2、內產生神經傳遞、味覺、嗅覺、視覺及細胞的新陳代謝、分化、增殖、分泌等一系列生理效應。G蛋白種類較多，但所有類型G蛋白都由3個不同的亞單位即α、β、γ所組成。α亞單位具有特異的GTP結合位點，有GTP酶活性。根據G蛋白的α亞單位的結構，可將其分為4個亞家族：Gs，Gi/o，Gq和G12。 M電流最早于1980年由Brown和Admas在牛蛙頸上交感神經節(jié)中發(fā)現(xiàn)，是一種慢激活、非失活的電壓依賴型外向鉀離子電流，因其可被激活后的毒蕈堿

3、受體(M受體)所抑制而得名。M電流的抑制將導致神經系統(tǒng)興奮性升高。M通道的功能失調與良性家族性新生兒驚厥癥(BFNCs)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer)、癲癇等疾病密切相關。M通道的分子基礎是KCNQ鉀離子通道，目前已經發(fā)現(xiàn)了5種KCNQ亞型：KCNQ1～5，其中KCNQ2-5，尤其是KCNQ2/Q3參與構成M電流。在對M電流調節(jié)機制的研究中已經發(fā)現(xiàn)一些Gq蛋白偶聯(lián)受體激活后能引起M電流的抑制。由Gq蛋白偶聯(lián)受體介導的磷脂酶C(P

4、LC)信號轉導通路被認為是其抑制M電流的主要途徑。目前已證明，Gaq蛋白激活后首先激活PLCβ，進而水解胞膜PIP2，PIP2水解生成兩種第二信使IP3與DAG，IP3可引發(fā)細胞內質網鈣庫釋放，而DAG則進一步激活PKC。PIP2水解、PKC及細胞內鈣離子均可能在GPCRs調節(jié)M電流過程中發(fā)揮了作用。然而，對于是否所有Ga蛋白偶聯(lián)受體激活對KCNQ/M電流的調節(jié)作用是否利用同樣的機制還不甚明了。 目的：觀察HEK293細胞中外源

5、性表達的組胺(H1)、血管緊張素Ⅱ(AT1)、嘌呤(P2Y1和P2Y2)受體對共表達的KCNQ2/3通道電流的抑制作用，以細胞膜PIP2及細胞內鈣釋放為主要觀察點，研究抑制作用的信號通路機制，并為以后的實驗打下基礎。 方法：用全細胞膜片鉗記錄電流變化：用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀測細胞膜PIP2敏感熒光探針(PLC -PH-GFP)在細胞膜與細胞漿問的轉位情況，進而了解PIP2的水解情況；用LSCM及雙波長比例法鈣成像技術測

6、定細胞內鈣離子濃度變化。 結果： (1)用全細胞膜片鉗方法記錄到的HEK293細胞表達的外源性的KCNQ2/3電流可以被共表達的H1、AT1、P2Y1和P2Y2受體激活后所抑制，H1、AT1、P2Y1和P2Y2激活對KCNQ2/3電流的抑制率分別為87.7％±6.9％(n=7)，55.0％±4.9％(n=4)，57.7％±5.1％(n=6)和62.0％±3.1％(n=6)。 (2)LSCM觀察HEK293細胞膜P

7、IP2水解情況：以上四種受體激動后均可明顯見到熒光探針(PLC -PH-GFP)從胞膜處向胞漿處的轉位，洗掉受體激動藥物后，熒光探針又重新由胞漿轉位到胞膜(復位)，呈現(xiàn)一種可逆性變化。在P14激酶抑制劑wortmannin持續(xù)存在的情況下，熒光探針由胞漿到胞膜的復位被抑制，說明熒光探針的復位是P14激酶介導的PIP2的再合成的結果。用PLC阻斷劑U73122預先孵育細胞后，受體激活導致的由胞膜向胞漿的熒光轉位不再發(fā)生，說明受體激活導致的

8、熒光探針轉位是PLC介導的PIP2水解的結果。 (3)用LSCM及雙波長比例法鈣成像技術測定細胞內鈣離子濃度變化：以上四種受體激動后無論是否有無外鈣存在，均可引起細胞內鈣升高，這種作用可被U73122阻斷。 (4)組胺H1受體激動后抑制KCNQ2/3電流機制的研究：用全細胞膜片鉗方法記錄HEK293細胞表達的KCNQ2/3電流，觀察激活表達的H1受體對KCNQ2/3電流抑制作用，并觀察PLC阻斷劑U-73122、PI4激

9、酶阻斷劑wortmannin和鈣庫耗竭劑thapsigargin對上述作用的影響，從而推斷PIP2及細胞內鈣在H1受體激活抑制KCNQ2/3電流中的作用。PLC阻斷劑U73122可使電流抑制率由74.5±0.6％(n=5)顯著下降到7.14±0.6％(n=5，p＜0.01)，基本取消了H1受體激活對電流的抑制作用，說明H1受體是通過激活PLC對KCNQ2/3電流產生抑制的：P14激酶抑制劑wortmannin使電流被抑制后的恢復率由88

10、.4±6.2％(n=7)顯著下降到10.5±3.4％(n=8，p＜0.01)，說明PIP2的再合成是組胺通過H1受體抑制KCNQ2/3電流后電流恢復的必要條件：內鈣庫耗竭劑thapsigargin應用前后電流抑制率分別為90.0±1.6％(n=6)，88.6±3.9％(n=6，p＞0.05)，無顯著性差別，說明細胞內鈣的釋放沒有參與組胺H1受體抑制KCNQ2/3電流的過程。 結論：結果表明在HEK293細胞中，H1、AT1、P2