Notch信號對血管結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】
　　自1971年Folkman首次提出了實(shí)體腫瘤生長的血管依賴性以來,通過抑制腫瘤血管生成使得腫瘤內(nèi)部氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)匱乏以“餓死”腫瘤細(xì)胞的策略一度是腫瘤血管靶向療法的核心思路,并催生了VEGF的人源化單抗貝伐單抗(Bevacizumab)、索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib)等VEGF-VEGFR信號通路的多種阻斷性藥物的上市。然而10年過去了,臨床研究顯示它們僅對結(jié)腸癌、乳腺癌等一些特定

2、腫瘤的特定患者有效,并且隨著藥物的使用,耐藥問題和毒副作用日益明顯,另外,對于腫瘤血管生成的深入研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管結(jié)構(gòu)的高度紊亂不但阻礙了化療藥物向腫瘤組織的輸送,而且滲漏的血管可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,因而有學(xué)者提出了腫瘤血管“正?；辈呗?即采用多種方式促進(jìn)腫瘤血管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能完整,繼而與化療藥物聯(lián)用,可促進(jìn)化療藥物到達(dá)腫瘤組織內(nèi)部并提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性,從而殺死腫瘤細(xì)胞。這一思路的有效性在對脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白 PHD2的雜合缺

3、失小鼠的腫瘤血管生成的研究中得到證實(shí)。PHD2家族的成員可通過感知組織中的氧氣含量,靶向降解HIF家族成員而調(diào)控血管生成。PHD2單倍劑量缺失時(shí),腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接以及周細(xì)胞的募集均有所改善,表現(xiàn)為腫瘤血管的正常化。與化療藥物聯(lián)用時(shí),能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長,因而腫瘤血管“正常化”策略受到了越來越多的研究者的關(guān)注,同時(shí)也呼喚新的藥物靶點(diǎn)的出現(xiàn)。
　　2011年,在發(fā)表于Nature Medicine上的一篇題為“Tum

4、or angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets”的綜述中,談到尋找新的腫瘤血管靶點(diǎn)的時(shí)候,作者這樣說道:我們需要尋找這樣一條信號通路,第一點(diǎn),它能夠調(diào)控參與腫瘤血管生成的多種細(xì)胞的生長,第二點(diǎn)是最好具有靶向選擇性。我們實(shí)驗(yàn)室長期從事研究的Notch信號通路對參與腫瘤血管生成多種細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞等均有重要調(diào)節(jié)作用。那么它能否作為腫瘤血管正?；男碌陌悬c(diǎn),我

5、們是該在腫瘤血管中阻斷 Notch信號還是應(yīng)該激活 Notch信號?以及如何解決它的靶向選擇性的問題呢?
　　前期研究發(fā)現(xiàn)阻斷 Notch信號,如對 Notch信號通路在血管生成中的主要配體Dll4的阻斷可促進(jìn)腫瘤組織血管新生,但由于新生血管的周細(xì)胞覆蓋降低和血管結(jié)構(gòu)不完整造成血液滲漏增加,使得腫瘤血液灌流降低從而造成腫瘤組織缺氧增加,最終減緩腫瘤的生長。在臨床研究中發(fā)現(xiàn),Dll4靶向siRNA和貝伐單抗的聯(lián)合使用在卵巢癌的治療中

6、有更好的治療效果。但是后來在小鼠、大鼠和短尾猴中的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Dll4的抗體能夠?qū)е卵芰龅漠a(chǎn)生,強(qiáng)烈限制了Dll4阻斷性抗體的臨床應(yīng)用。另一方面,對于 Notch信號激活的研究顯示 Notch的激活也能通過能夠抑制腫瘤血管的生成而抑制腫瘤的生長。我們實(shí)驗(yàn)室張建平碩士的研究顯示,過表達(dá) Notch配體Dll1的腫瘤生長顯著減緩,并且這種減緩就是通過腫瘤血管生成的減少實(shí)現(xiàn)的。因而,從長期療效來看,在腫瘤血管中激活 Notch信號通路相對抑

7、制 Notch信號通路有更大的應(yīng)用潛質(zhì)。然而對于激活Notch信號來說,最大的挑戰(zhàn)就是可溶性的Notch配體不能很好的激活 Notch信號,甚至可能由于不能有效的介導(dǎo) Notch受體胞外段的內(nèi)吞反而抑制了內(nèi)源性的Notch信號。因而,我們擬設(shè)計(jì)一種新型的由hDll1配體的DSL結(jié)構(gòu)域和RGD九肽融合組成的Notch激活型配體hD1R,借助于RGD與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素分子αVβ3的結(jié)合,促進(jìn)其特異性結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面并促進(jìn)其內(nèi)吞

8、,從而達(dá)到高效激活Notch信號的目的。
　　綜上,我們擬通過利用基因修飾小鼠模型和荷瘤小鼠模型,在進(jìn)一步明確Notch信號對腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控,尤其是有無促進(jìn)腫瘤血管正?；哪芰Φ幕A(chǔ)上,探索Notch信號新型活化配體hD1R能否靶向內(nèi)皮細(xì)胞激活Notch信號,以及對腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能和腫瘤生長的影響。繼而,采用全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)合分子生物學(xué)手段,對Notch信號調(diào)控血管結(jié)構(gòu)和功能的分子機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　

9、【研究目的】
　　明確Notch信號對于腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控作用,設(shè)計(jì)合成 Notch信號新型活化配體hD1R,研究其能否靶向內(nèi)皮細(xì)胞激活Notch信號,能否抑制腫瘤生長,能否通過活化 Notch信號調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能,從而為腫瘤的血管靶向治療提供新的策略和提供一種可能的候選藥物。在此基礎(chǔ)上,對 Notch信號調(diào)控血管結(jié)構(gòu)和功能的分子機(jī)制進(jìn)行探索。
　　【研究方法】
　　1.Notch信號缺失對腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能

10、的影響利用Mx-Cre; RBP-Jflox小鼠,于小鼠出生6周后開始腹腔注射poly:I-C誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子RBP-J的在內(nèi)皮細(xì)胞的敲除,誘導(dǎo)四次之后制作LLC荷瘤小鼠,通過腫瘤切片的免疫熒光染色觀察Notch信號缺失對腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能的影響。
　　2.內(nèi)皮細(xì)胞特異性Notch信號激活對腫瘤生長和腫瘤血管結(jié)構(gòu)、功能的影響利用Cdh5CreERT; ROSAN1-IC小鼠,通過他莫昔芬的注射誘導(dǎo) NICD的表達(dá),制作 LLC荷瘤小鼠

11、,觀察內(nèi)皮細(xì)胞特異性 Notch信號活化對腫瘤生長的影響,通過腫瘤切片的免疫熒光染色觀察Notch信號活化對腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能的影響。
　　3.hD1R的構(gòu)建、表達(dá)和純化利用PCR技術(shù)克隆目的基因,分子克隆相關(guān)技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體,大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)目的蛋白,用鎳離子螯合柱通過親和層析的方法純化出目的蛋白。
　　4.hD1R的生物活性檢測利用細(xì)胞爬片的免疫熒光、流式細(xì)胞和細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)觀察hD1R與內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合;利用

12、細(xì)胞爬片的免疫熒光、Western Blot和實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)觀察hD1R對Notch信號的激活;利用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)觀察hD1R激活Notch信號是否通過促進(jìn)Notch受體胞外段的內(nèi)吞實(shí)現(xiàn)的。
　　5.hD1R的功能實(shí)驗(yàn)利用管腔形成實(shí)驗(yàn)和內(nèi)皮細(xì)胞出芽實(shí)驗(yàn)觀察hD1R對體外管腔形成能力的影響;利用新生鼠視網(wǎng)膜血管新生模型做視網(wǎng)膜的Whole-mount免疫熒光染色觀察hD1R對視網(wǎng)膜血管生成和Tip細(xì)胞形成的影響,視網(wǎng)膜切片的

13、免疫熒光染色觀察hD1R對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　6.hD1R對腫瘤生長及腫瘤血管生成的影響利用裸鼠的荷瘤小鼠模型觀察 hD1R對腫瘤生長的影響;通過腫瘤組織切片的H&E和免疫熒光染色觀察hD1R對腫瘤壞死和缺氧的影響;通過體外腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)觀察hD1R對腫瘤細(xì)胞增殖的影響,Annexin V和PI雙標(biāo)的流式細(xì)胞觀察hD1R對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響;通過腫瘤組織切片的免疫熒光染色和掃描電鏡技術(shù)觀察 hD1R對腫瘤血管周細(xì)胞募集

14、的影響,腫瘤血管超微結(jié)構(gòu)的影響和腫瘤組織血液灌流的影響。
　　7.D1R的毒副作用小鼠各主要器官的H&E染色觀察mD1R對小鼠各器官的毒副作用;小鼠骨髓、胸腺和脾臟的流式細(xì)胞觀察mD1R對小鼠免疫細(xì)胞分化的影響。
　　8.hD1R對于正常血管的成熟和穩(wěn)定的影響1) Notch信號對內(nèi)皮細(xì)胞連接的影響主要通過體外培養(yǎng)HUVECs,做細(xì)胞爬片的免疫熒光染色和Western Blot觀察hD1R或GSI對內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子VE-Ca

15、dherin和β-Catenin表達(dá)變化,從而判斷Notch信號改變對內(nèi)皮細(xì)胞連接的影響2)對新生鼠進(jìn)行hD1R皮下注射,獲取視網(wǎng)膜血管網(wǎng)組織,對視網(wǎng)膜切片進(jìn)行Lectin和α-SMA的免疫熒光染色,并對共聚焦斷層掃描的結(jié)果進(jìn)行三維重建,觀察視網(wǎng)膜血管的周細(xì)胞覆蓋情況。
　　9.Notch信號調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能可能通過的靶分子利用新生鼠視網(wǎng)膜血管新生模型分離小鼠視網(wǎng)膜血管組織,提取RNA送公司做小鼠全基因組表達(dá)譜芯片。利用MeV-

16、TM4和GSEA軟件做聚類分析尋找差異基因,用DAVID在線軟件做功能分類尋找與細(xì)胞粘附和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)差異基因,通過實(shí)時(shí)定量對差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　【研究結(jié)果】
　　1.Notch信號在內(nèi)皮細(xì)胞的敲除和過度激活影響腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能1)利用Mx-Cre;RBP-Jflox小鼠,在內(nèi)皮細(xì)胞中剔除Notch信號核心轉(zhuǎn)錄因子RBP-J,可減緩腫瘤細(xì)胞 LLC的生長并破壞腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能。腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示RBP-J剔

17、除組 LLC的生長受到抑制,并且腫瘤組織切片的免疫熒光染色結(jié)果顯示RBP-J剔除組腫瘤組織缺氧增加,腫瘤血管基底膜形成不完整,血液灌流減少。2)利用Cdh5CreERT;ROSAN1-IC小鼠荷瘤模型,在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性激活Notch信號,也可顯著抑制腫瘤細(xì)胞 LLC的生長。腫瘤切片的免疫熒光染色結(jié)果顯示,Notch信號的過度激活能夠通過促進(jìn)周細(xì)胞的募集和腫瘤組織血液灌流促進(jìn)腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能正常化。
　　2.構(gòu)建、表達(dá)、純化

18、了新型血管靶向Notch信號激活劑hD1R,證明其能靶向血管內(nèi)皮,高效激活Notch信號。我們將Notch配體Dll1(Delta-Like1)的DSL結(jié)構(gòu)域和整合素αVβ3的特異性配體RGD九肽融合,在大腸桿菌中成功表達(dá)出Trx-hD1R,同時(shí)表達(dá)了Trx-hD1S(Stop終止密碼子)和Trx-hD1D(DGR九肽)作為對照,鎳離子螯合柱純化得到蛋白后用Thrombin切掉Trx標(biāo)簽后再用鎳離子螯合柱純化得到目的蛋白。之后我們通過細(xì)

19、胞爬片的免疫熒光、流式細(xì)胞和細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)證實(shí)hD1R能夠特異性的結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面,細(xì)胞爬片的免疫熒光、Western Blot和實(shí)時(shí)定量的結(jié)果顯示 hD1R能夠在體外和體內(nèi)高效的激活 Notch信號,并且內(nèi)吞抑制劑Dynasore能夠顯著抑制hD1R激活的Notch信號,說明hD1R主要是通過結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面促進(jìn)Notch受體胞外段的內(nèi)吞來高效激活Notch信號的。
　　3.hD1R能夠在體外和體內(nèi)抑制血管生成。我們通過體

20、外管腔形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hD1R能夠明顯抑制管腔分支數(shù)的形成和管腔長度,內(nèi)皮細(xì)胞出芽實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) hD1R能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞向外形成出芽和形成管腔。體內(nèi)新生鼠視網(wǎng)膜血管新生模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),hD1R能夠顯著抑制神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層血管網(wǎng)的形成,并且主要是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和Tip細(xì)胞的形成實(shí)現(xiàn)的。
　　4.hD1R能夠通過抑制腫瘤血管生成抑制腫瘤生長。我們通過裸鼠的荷瘤小鼠模型證實(shí)了hD1R能夠抑制U87、LLC和MCF-7的生長,腫瘤組織切

21、片染色發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死區(qū)域明顯增加,腫瘤組織缺氧明顯增加。CD31的免疫熒光染色顯示hD1R組,血管生成明顯降低,并且hD1R與CD31有明顯的共定位,表明hD1R通過抑制了腫瘤組織血管生成從而造成腫瘤組織中壞死的增加和缺氧的增加而抑制腫瘤的生長。另外腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,hD1R對腫瘤細(xì)胞的增殖沒有影響,腫瘤細(xì)胞Annexin V和PI雙標(biāo)的流式細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)hD1R蛋白對腫瘤細(xì)胞的凋亡沒有影響。
　　5.hD1R 能夠促進(jìn)腫

22、瘤血管結(jié)構(gòu)和功能正?；Ｄ[瘤組織 CD31和NG2 雙標(biāo)的免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hD1R 處理組腫瘤血管周細(xì)胞的覆蓋明顯增加；掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于對照組腫瘤血管內(nèi)存在大量纖維物質(zhì)和血管周存在外滲漏樣物質(zhì)，第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文8hD1R 處理組腫瘤血管的結(jié)構(gòu)明顯有所改善；小鼠尾靜脈注射 Lectin 檢測腫瘤組織血液灌流情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) hD1R 組 Lectin 陽性信號明顯增加，表明 hD1R 促進(jìn)了腫瘤組織血液灌流。以上這些結(jié)

23、果表明 hD1R 激活的Notch 信號能夠促進(jìn)腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能的正?；?。
　　6.D1R 在小鼠體內(nèi)無毒副作用。我們通過小鼠主要器官包括大腦、心、肝、肺、腎的H&E 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D1R 蛋白處理組小鼠的主要器官并沒有發(fā)生明顯的病變。
　　流式細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn) D1R 蛋白對小鼠骨髓 B 細(xì)胞、胸腺 T 細(xì)胞、脾臟 B 細(xì)胞和脾臟 T細(xì)胞的分化沒有影響。
　　7.Notch 信號參與調(diào)節(jié)生理性血管的結(jié)構(gòu)和功能。我們通過

24、Western Blot和細(xì)胞爬片的免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn) hD1R 能夠上調(diào)粘附連接蛋白 VE-Cadherin和β-Catenin的表達(dá)，Notch 信號阻斷劑 GSI 能夠顯著抑制其表達(dá)。另外細(xì)胞爬片的免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn) GSI的處理能夠?qū)е娄?Catenin的定位由由胞膜轉(zhuǎn)向胞漿。利用Mx-Cre;RBP-JFlox小鼠剔除血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notch 信號核心轉(zhuǎn)錄因子RBP-J 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，剔除組小鼠視網(wǎng)膜和大腦的上丘腦有明顯的血液

25、滲漏的情況。利用新生鼠視網(wǎng)膜血管新生模型通過視網(wǎng)膜切片的Lectin和α-SMA雙標(biāo)的免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hD1R組α-SMA 陽性的周細(xì)胞明顯增加。我們將共聚焦斷層掃描的結(jié)果進(jìn)行三維重建，結(jié)果發(fā)現(xiàn) hD1R 組血管周圍綠色標(biāo)記的α-SMA 信號明顯多于對照組。以上的這些結(jié)果表明 Notch 信號能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞連接的形成和周細(xì)胞的募集來調(diào)控生理性血管的結(jié)構(gòu)和功能。
　　8.Notch 信號可能通過LAMB1、PCDH18、AN

26、GPTL4和HSPG2 調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能。我們將給予 DMSO和GSI 注射的新生鼠視網(wǎng)膜血管組織分離，提取 RNA，做全基因組表達(dá)譜芯片。我們利用 MeV-TM4 軟件做聚類分析，找出變化顯著的差異基因 231 個(gè)，利用 GSEA 軟件找出 113 個(gè)變化有趨勢的差異基因，將這 344 個(gè)差異基因用 DAVID 在線軟件分析，從中找出 17 個(gè)細(xì)胞粘附相關(guān)差異基因和9 個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)差異基因，并通過實(shí)時(shí)定量篩選出 LAMB1、PC

27、DH18、ANGPTL4和HSPG2四個(gè)基因可能為 Notch 信號的下游靶基因。
　　【結(jié)論】
　　在血管內(nèi)皮細(xì)胞剔除 Notch 信號信號關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J 可顯著破壞腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能，并減緩腫瘤生長。在血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性激活 Notch 信號通路也可抑制腫瘤生長，并且促進(jìn)了腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能的正常化。以上結(jié)果說明 Notch信號對腫瘤血管生成和腫瘤血管的結(jié)構(gòu)、功能具有重要調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，本研究成功構(gòu)建、

28、表達(dá)和純化了一種新型的血管靶向 Notch 配體 hD1R，其能在體外、體內(nèi)特異性的結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面，通過促進(jìn) Notch 受體胞外段的內(nèi)吞高效激活Notch 信號。功能研究發(fā)現(xiàn) hD1R 能在體外、體內(nèi)抑制管腔形成和血管生成，并且是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和Tip 細(xì)胞形成實(shí)現(xiàn)的。hD1R 可以通過抑制腫瘤組織血管生成造成腫瘤組織壞死增加和缺氧增加從而抑制腫瘤的生長，并且 hD1R 可以促進(jìn)正常血管的成熟和穩(wěn)定以及腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能正