Notch信號(hào)途徑對(duì)小細(xì)胞肺癌的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor,NET)由具有多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞形成,與普通型肺癌相比,其不僅在組織形態(tài)上具有明顯的異質(zhì)性,而且在腫瘤生物學(xué)行為以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性上也存在著顯著差異。肺NET可以生成多種神經(jīng)內(nèi)分泌(NE)標(biāo)志物和活性激素,主要包括:嗜鉻素蛋白A(CgA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、抗利尿激素(ADH)等,這些異位激素的產(chǎn)生,可引起內(nèi)分泌、神經(jīng)、消化、

2、造血、腎臟、骨關(guān)節(jié)及皮膚等系統(tǒng)和器官發(fā)生病變,并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn),在臨床上統(tǒng)稱為“副腫瘤綜合癥”。小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的一種。關(guān)于它的起源,目前存在著兩種觀點(diǎn):一種認(rèn)為它起源于支氣管粘膜上皮內(nèi)Kulchitsky細(xì)胞,而另一種則認(rèn)為它是由支氣管粘膜干細(xì)胞分化而來(lái)。在肺癌中,小細(xì)胞肺癌的發(fā)生率較高,僅低于肺鱗癌及腺癌,其發(fā)生率約占原發(fā)性肺癌的20％-25%。本癌的惡性度極

3、高,生長(zhǎng)迅速,多數(shù)存活期不超過(guò)一年,因多有早期轉(zhuǎn)移,一般不適合手術(shù)切除,目前小細(xì)胞肺癌的治療及預(yù)后尚無(wú)突破性進(jìn)展。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切,在許多腫瘤細(xì)胞系中檢測(cè)到Notch基因表達(dá)的異常,且紊亂的Notch途徑在維持腫瘤表型方面起著重要作用。Notch基因編碼一種300 kD的跨膜蛋白受體,受體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)是Notch的活化形式,當(dāng)受體與配體結(jié)合時(shí),Notch受體經(jīng)γ一分泌酶水解剪切并釋放其胞內(nèi)段的活性部分(

4、NIC),隨后,NIC轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中NIC的直接靶蛋白包括CBF-1,當(dāng)CBF-1與NIC結(jié)合后,通過(guò)蛋白的構(gòu)象改變使原先被抑制的位于CBF-1結(jié)合序列下游的基因開(kāi)放表達(dá)。Notch途徑的下游基因包括HES基因家族和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白基因。HES基因家族編碼一類含有特征性α螺旋-環(huán)-螺旋(αHLH)結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白,它可結(jié)合在hASH1基因的啟動(dòng)子上,從而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄。迄今,有關(guān)肺癌神

5、經(jīng)內(nèi)分泌分化的調(diào)節(jié)以及維持的分子機(jī)制尚不十分清楚,但有研究表明,hASH1基因的表達(dá)與肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分化表型和分化程度密切相關(guān)。因此Notch信號(hào)途徑就可以通過(guò)靶基因HES對(duì)分化效應(yīng)基因hASH1的抑制,來(lái)間接地對(duì)肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進(jìn)行調(diào)控。目前,已經(jīng)有人對(duì)Notch信號(hào)途徑在小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控進(jìn)行了研究,但研究的內(nèi)容還局限于分子調(diào)控機(jī)制和形態(tài)學(xué)等方面,如Notch1可引起小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中hASH1表達(dá)的顯著降低,Notch信號(hào)途徑可

6、以抑制小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和增殖等。在胰腺癌當(dāng)中,Notch信號(hào)途徑可以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物的生成,但在肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中還未曾有過(guò)這方面的報(bào)道。因此我們考慮采用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法,在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中表達(dá)組成性活化的Notch1,來(lái)研究Notch信號(hào)途徑對(duì)小細(xì)胞肺癌的調(diào)控作用,特別是轉(zhuǎn)染前后癌細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物表達(dá)的變化,通過(guò)以上研究,為目前缺乏有效治療手段的小細(xì)胞肺癌患者提供治療的新思路。材料和方法本實(shí)驗(yàn)采用的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

7、株為NCI-H446。重組質(zhì)粒PEFBOS-NIC-MYC由第四軍醫(yī)大學(xué)遺傳與發(fā)育生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。首先我們把獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到感受態(tài)大腸桿菌中,進(jìn)行了質(zhì)粒抽提并送到公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果出來(lái)后我們對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,同時(shí)設(shè)定兩個(gè)對(duì)照組(即轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組BOS-446和未轉(zhuǎn)染組control-446),待藥物篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株后,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),最后通過(guò)RT-PCR方法對(duì)各組細(xì)胞的Notch1、HES1及hASH1基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)M

8、TT實(shí)驗(yàn)對(duì)三組細(xì)胞的增殖活力進(jìn)行了對(duì)比分析,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記和Western blot技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染前后NE細(xì)胞標(biāo)志物(CgA、NSE)的變化進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果1.RT-PCR檢測(cè)目的基因和下游基因的表達(dá):在兩個(gè)對(duì)照組中(control-446和BOS-446)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Notch1、HES1基因的表達(dá),而在轉(zhuǎn)染組中(NIC-446)發(fā)現(xiàn)了Notch1、HES1基因的表達(dá)。在兩個(gè)對(duì)照組中有hASH1的表達(dá),而在轉(zhuǎn)染組中hASH1的表達(dá)明顯

9、降低。2.細(xì)胞活力分析:我們對(duì)三組細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了對(duì)比分析,各組細(xì)胞以2X10～3/孔接種至96孔板(3復(fù)孔),連續(xù)六天用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力明顯降低,與對(duì)照組(control-446和BOS-446)之間有顯著差異(P=0.037和0.043,t檢驗(yàn))。3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果:三組細(xì)胞爬片后進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記,爬片應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組的這兩種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表

10、達(dá)量顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,t檢驗(yàn))。4.Western blot檢測(cè)目的蛋白和神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá):在轉(zhuǎn)染組中存在NIC-MYC融合蛋白的表達(dá),在對(duì)照組中未見(jiàn)目的蛋白的表達(dá)。在兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞中,NE標(biāo)志物CgA、NSE具有明顯的表達(dá),表現(xiàn)為條帶較亮,而在轉(zhuǎn)染組中,兩個(gè)蛋白的表達(dá)量顯著降低,表現(xiàn)為條帶較暗。用凝膠成像分析系統(tǒng)Quantityone對(duì)條帶密度進(jìn)行半定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)