Notch信號(hào)調(diào)控髓系細(xì)胞參與腎纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】
　　全球約有13％-15%的成年人患有慢性腎臟?。–hronic renal disease，CKD），腎臟纖維化是慢性腎臟病進(jìn)展性損傷的共同病理過程，其主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白）的大量產(chǎn)生和堆積。此外腎纖維化導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害，小管上皮喪失再生能力，間質(zhì)毛細(xì)血管的完整性受損，進(jìn)一步導(dǎo)致組織局部缺氧，加重?fù)p傷和纖維化。隨著病情進(jìn)展，腎功能進(jìn)行性減退，發(fā)展為腎衰竭，患者可能需要血液透

2、析、腹膜透析和腎移植這些腎臟替代治療，但多數(shù)患者會(huì)死于慢性腎臟病的并發(fā)癥，如：心血管疾病。因而，研究腎纖維化發(fā)病的細(xì)胞學(xué)和分子機(jī)制具有重要的臨床意義。
　　腎纖維化的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，研究表明：細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源是肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MFB)。在損傷因素刺激下，成纖維細(xì)胞活化為MFB，血管內(nèi)皮細(xì)胞向MFB轉(zhuǎn)變（Endothelial to mesenchymal transition,EndMT）

3、，腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)，周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以及骨髓來源的細(xì)胞在損傷因素刺激下也可以向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。
　　除肌成纖維細(xì)胞外，單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（Dendriticcells，DCs）、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞在腎纖維化的進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用。腎臟損傷后，損傷的實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放一系列炎性介質(zhì)、趨化因子，募集炎性細(xì)胞到腎臟間

4、質(zhì)，此外腎臟固有的免疫細(xì)胞在損傷因素刺激下會(huì)發(fā)生活化，研究表明募集的炎性細(xì)胞和腎臟原位活化的免疫細(xì)胞共同參與腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。然而，炎性細(xì)胞參與腎纖維化的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　Notch信號(hào)途徑是進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路，可以調(diào)控胚胎發(fā)育以及成體組織穩(wěn)態(tài)。研究表明Notch信號(hào)不僅參與淋巴細(xì)胞的發(fā)育，也參與髓系細(xì)胞的發(fā)育，尤其對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活化發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在一些關(guān)鍵性生長(zhǎng)因子作用下由骨髓中共

5、同前體細(xì)胞發(fā)育而來。腎臟樹突狀細(xì)胞（DCs)屬于髓系細(xì)胞，主要位于腎間質(zhì)，是經(jīng)典的抗原提呈細(xì)胞（Antigen presenting cells，APC)，能夠?qū)?nèi)源性和外源性的有害信號(hào)做出反應(yīng)，起始和引發(fā)針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)免疫耐受功能，保護(hù)腎臟免受感染。樹突狀細(xì)胞參與多種腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，并參與后續(xù)的組織再生。Notch信號(hào)可以調(diào)控樹突狀細(xì)胞的活化，Notch信號(hào)調(diào)控樹突狀細(xì)胞在腎臟病中的研究尚未見報(bào)道。
　　大量

6、研究證實(shí)巨噬細(xì)胞在腎纖維化過程中具有促纖維化形成以及促纖維化降解的雙重作用。巨噬細(xì)胞主要位于腎小球周圍，在髓質(zhì)腎小管周圍也可見到巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是造血系統(tǒng)中可塑性最強(qiáng)的一種細(xì)胞，在正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和對(duì)病原體的免疫反應(yīng)中起很多不同作用，作為非經(jīng)典的APC，其主要功能是維持組織穩(wěn)態(tài)，吞噬清除自身組織碎片以及異物。巨噬細(xì)胞在腎纖維化過程中可以發(fā)揮促炎、促纖維化、以及促纖維化降解作用。巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性可能決定其對(duì)腎纖維化的雙重作用

7、。也可以根據(jù)其來源不同將巨噬細(xì)胞分為炎性巨噬細(xì)胞和組織定居巨噬細(xì)胞，不同來源的巨噬細(xì)胞對(duì)疾病的預(yù)后也產(chǎn)生不同的影響。研究證明：巨噬細(xì)胞在腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用，但是詳細(xì)的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，在巨噬細(xì)胞中特異性敲除Notch信號(hào)，腎纖維化減輕（單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型，2周），炎性腎臟中巨噬細(xì)胞減少。提示：Notch信號(hào)途徑調(diào)控巨噬細(xì)胞參與腎纖維，但分子機(jī)制尚不清楚。
　　綜上所述，本

8、課題將利用在CD11C陽性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中特性剔除Notch信號(hào)的小鼠，結(jié)合單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型（Unilateral ureteral obstruction，UUO），研究它們?cè)谀I纖維化中的作用和機(jī)制。
　　【研究目的】
　　利用在CD11C陽性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中特性剔除Notch信號(hào)的小鼠，結(jié)合單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型（Unilateral ureteral obstruction，UUO），用免疫學(xué)和病理學(xué)等方法，從分子水平，

9、細(xì)胞水平和動(dòng)物水平，研究Notch信號(hào)調(diào)控髓系細(xì)胞參與腎纖維化的機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)治療腎纖維化的新靶點(diǎn)和策略。
　　【研究方法】
　　1.CD11C陽性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞剔除Notch信號(hào)，巨噬細(xì)胞過表達(dá)Notch信號(hào)等遺傳修飾小鼠的培育和繁殖。
　　2.UUO模型的建立以及纖維化水平的檢測(cè)（Masson、天狼星紅、免疫熒光，實(shí)時(shí)定量PCR）。
　　3.免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)UUO模型中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
　

10、　4.小鼠原代腎小管上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。檢測(cè)小管上皮EMT的變化。
　　5.流式分選出纖維化腎臟巨噬細(xì)胞，分別提取RNA，檢測(cè)趨化因子受體CCR2的表達(dá)。
　　6.構(gòu)建單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1載體。
　　7.利用Transwell試驗(yàn)檢測(cè)Notch信號(hào)對(duì)巨噬細(xì)胞遷移能力的影響。
　　8.利用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，CHIP）檢測(cè)Notch

11、信號(hào)對(duì)CCR2的調(diào)控。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1.成功建立小鼠UUO模型。
　　2.在CD11C陽性細(xì)胞中敲除Notch信號(hào)，對(duì)UUO2W時(shí)的腎纖維化無顯著影響。在巨噬細(xì)胞中敲除Notch信號(hào)，腎纖維化減輕（前期研究結(jié)果）。
　　3.成功培養(yǎng)原代腎小管上皮細(xì)胞，巨噬細(xì)共培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除巨噬細(xì)胞中Notch信號(hào)能減輕腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，減輕腎纖維化。
　　4.巨噬細(xì)胞敲除Notch信號(hào)后CCR2表達(dá)下