自噬對非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥的調(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、第一部分自噬與非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥的關系
　　目的：構建EGFR-TKI耐藥細胞株并探索EGFR-TKI耐藥與自噬活動的關系。
　　方法：選取4種NSCLC細胞系HCC827，A549，H460和H1975,進行基因檢測以驗證其EGFR突變狀態(tài)，并通過CCK8測定其對erlotinib的敏感性。以EGFR-TKI敏感細胞HCC827為基礎,通過長期且濃度遞增的erlotinib處理以誘導出EGFR-TKI耐藥細胞

2、株，并通過CCK8鑒定其對erlotinib的敏感性，命名為HCC827-R。通過Western blotting檢測HCC827，A549，H460，H1975和HCC827-R5種細胞的基礎自噬水平，并通過GFP-LC3和CQ(chloroquine)進一步驗證HCC827和HCC827-R的自噬流水平。通過抑制劑（CQ或3-MA）或siRNA抑制基礎自噬觀察其對細胞增殖的影響。
　　結果：EGFR基因檢測結果為：HCC827

3、(E746- A750 deletion), A549(wild type), H460(wild type), H1975(L858R and T790M),通過CCK8藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)HCC827對erlotinib敏感，而A549, H460, H1975和HCC827-R對erlotinib抗拒，其中HCC827-R對erlotinib的IC50值大于100μM。綜合比較HCC827, A549, H460, H1975和HC

4、C827-R的EGFR-TKI敏感性和基礎自噬水平發(fā)現(xiàn)，從HCC827到HCC827-R，細胞對erlotinib的藥物敏感性逐漸降低，而 LC3-II水平，即基礎自噬水平逐漸增高。通過 GFP-LC3和CQ的介入進一步證實，HCC827-R的基礎自噬流水平明顯高于HCC827。以3-MA或siRNA抑制基礎自噬后，HCC827和HCC827-R的增殖未受明顯影響。
　　結論：相對于 EGFR-TKI敏感細胞，EGFR-TKI耐藥

5、細胞擁有更高的基礎自噬水平，對EGFR-TKI的敏感性與細胞基礎自噬水平之間存在負相關性，基礎自噬活動不是細胞增殖的必需因素。
　　第二部分自噬對非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥的調(diào)控作用
　　目的：進一步探索自噬在 NSCLC細胞對 EGFR-TKI耐藥中的作用以及抑制自噬對EGFR-TKI耐藥的影響。
　　方法：通過不同時間不同濃度的erlotinib處理HCC827, A549, H1975和HCC827-R細胞

6、，觀察erlotinib對細胞自噬活動的影響。將自噬抑制劑（CQ或3-MA）與erlotinib聯(lián)合應用于HCC827, A549, H1975和HCC827-R細胞，觀察二者的聯(lián)合作用對自噬活動以及細胞增殖的影響。通過 Annexin V和 PI雙染檢測不同濃度的CQ或 CQ與erlotinib聯(lián)用對H1975或HCC827-R凋亡活動的影響，并以Western blotting進一步觀察PARP1和caspase3的變化。在CQ和e

7、rlotinib聯(lián)合作用下，以JC-1染色觀察線粒體膜電位的變化，并分別提取胞漿和線粒體蛋白以Western blotting檢測胞漿和線粒體中cytochrome c的含量。
　　結果：Erlotinib呈時間依賴性的誘導HCC827, A549, H1975和HCC827-R細胞自噬水平升高，而這一作用可以被自噬抑制劑3-MA或CQ阻斷。3-MA或CQ均與erlotinib表現(xiàn)出協(xié)同作用，抑制了HCC827, A549, H1

8、975和HCC827-R的細胞增殖，其中3-MA單藥對細胞生長無明顯的抑制作用，而CQ單藥使用時細胞生長和克隆形成均受到顯著抑制，提示作用于不同靶點的自噬抑制劑對NSCLC細胞增殖具有不同的影響。CQ與erlotinib聯(lián)合作用引起了H1975和HCC827-R凋亡水平增高，激活了PARP1與caspase3，而caspase抑制劑z-VAD fmk逆轉(zhuǎn)了這一聯(lián)合作用引起的細胞生長抑制。此外，CQ與 erlotinib聯(lián)合應用還引起了線

9、粒體膜電位的丟失和線粒體膜通透性的降低，表現(xiàn)為cytochrome c從線粒體釋放入胞漿。
　　結論：自噬抑制劑（3-MA或 CQ）抑制了 EGFR-TKI引起的自噬反應并進而逆轉(zhuǎn)了NSCLC細胞對EGFR-TKI的耐藥，CQ與erlotinib的聯(lián)合應用通過降低線粒體的膜電位和膜通透性引起NSCLC細胞發(fā)生caspase依賴性的凋亡反應。
　　第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在CQ逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥中的作用及機制
　　目的：

10、觀察線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活動在CQ逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥中的作用。
　　方法：通過GFP-LC3與線粒體示蹤劑mitotracker的共定位情況觀察線粒體自噬是否參與了CQ與erlotinib的聯(lián)合作用。在CQ與erlotinib的聯(lián)合作用下以Western blotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路蛋白EIF2α-CHOP的水平，并通過siRNA靶向敲除CHOP觀察其對H1975細胞凋亡和細胞增殖的影響。進而，通過JC-1染色和Wester

11、n blotting檢測靶向敲除CHOP后CQ與erlotinib聯(lián)合作用下線粒體膜電位和膜通透性變化。最后，通過建立H1975移植瘤模型，檢測CQ與erlotinib聯(lián)合作用對H1975移植瘤增殖的影響。
　　結果：在CQ與erlotinib聯(lián)合作用下，GFP-LC3未能與mitotracker形成熒光共定位，說明線粒體自噬未參與CQ與erlotinib的聯(lián)合作用。通過Western blotting發(fā)現(xiàn)CQ與erlotinib

12、聯(lián)合作用引起了EIF2α-CHOP通路的活化，說明其引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。對CHOP的敲除，逆轉(zhuǎn)了CQ與erlotinib聯(lián)合作用引起的凋亡反應和細胞生長抑制，并且抑制了線粒體膜電位和膜通透性的變化。在體內(nèi)試驗中，CQ與 erlotinib聯(lián)合作用顯著抑制了H1975移植瘤的生長。
　　結論：CQ與erlotinib聯(lián)合作用通過介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應進而引起線粒體膜電位和通透性的變化，最終引起凋亡，其中CHOP起到了凋亡信號從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應