Notch信號(hào)途徑對(duì)缺血-再灌注心肌的保護(hù)作用.pdf

1、【背景】
　　缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,I/RI)是指組織器官長(zhǎng)時(shí)間缺血后,恢復(fù)血液供應(yīng)時(shí)組織器官功能上的損傷不能得到恢復(fù),反而被加重。許多臨床案例證明僅僅缺血不足以導(dǎo)致組織損傷,而是在缺血一段時(shí)間后又突然恢復(fù)血供時(shí)才出現(xiàn)損傷。在創(chuàng)傷性休克、器官移植、血栓等血液循環(huán)障礙時(shí),都會(huì)出現(xiàn)缺血后再灌注損傷。缺血性心臟病是全球主要死亡原因之一,嚴(yán)重威脅著公眾健康。要挽救缺血心肌就必須及時(shí)、有效

2、的恢復(fù)缺血心肌的血流。但是,臨床發(fā)現(xiàn)有一部分病例在手術(shù)成功恢復(fù)缺血心肌血供后,卻導(dǎo)致心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)損傷致使病情反而惡化,出現(xiàn)進(jìn)行性心功能下降,甚至發(fā)生致死性心率失常。關(guān)于MI/R損傷的影響有三個(gè)方面:心肌超微結(jié)構(gòu)的變化、心肌能量代謝的變化以及心功能的變化。再灌注后由于恢復(fù)供氧而產(chǎn)生活性氧族(reactive oxygen species,ROS)增多,鈣離子超

3、載及炎癥反應(yīng)等均是引起MI/R損傷的機(jī)制,并直接或間接引起心肌細(xì)胞凋亡和壞死。
　　Notch信號(hào)途徑是影響細(xì)胞命運(yùn)的保守信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,決定著成年動(dòng)物組織和器官正常結(jié)構(gòu)和功能的維持及其受損后的修復(fù)。以哺乳動(dòng)物為例,經(jīng)典 Notch信號(hào)通路由5種配體(Delta-like1,3,4和Jagged1,Jagged2)和4種受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)組成,當(dāng)相鄰細(xì)胞間的Notch受體和配體相互作用后,

4、Notch受體的跨膜區(qū)依次在ADAM金屬蛋白酶和具有γ分泌酶活性的Presenilin或Nicastrin的作用下從近膜處裂解,釋放出Notch胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain,NICD)并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。進(jìn)入核內(nèi)的NICD可通過(guò)RAM結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J(recombination signal binding protein J)相互作用,激活含有RBP-J識(shí)別位點(diǎn)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化相關(guān)

5、基因的表達(dá)。目前,僅有極少一部分RBP-J下游靶基因得到鑒定。最常見(jiàn)的下游靶基因是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子,如Split家族Hairy增強(qiáng)子(hairy/Enhancer of split,Hes)等。在哺乳動(dòng)物的四種Notch受體都需要RBP-J來(lái)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活活性。有文獻(xiàn)顯示,外界刺激使細(xì)胞產(chǎn)生 Notch信號(hào)途徑的應(yīng)答,在肝臟和腦缺血性損傷中Notch信號(hào)途徑都有參與。在MI/R損傷的過(guò)程時(shí),Notch信號(hào)途徑是否參與其中?Notch信號(hào)

6、途徑在此過(guò)程中起到什么作用?Notch信號(hào)途徑發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制是什么?對(duì)這些問(wèn)題的研究將進(jìn)一步完善MI/R損傷的分子調(diào)控理論體系,可為MI/R損傷的預(yù)防提供理論基礎(chǔ),更可為MI/R損傷相關(guān)的治療提供新的視角。
　　【目的】
　　研究Notch信號(hào)途徑在MI/R損傷中的作用,觀察缺氧/復(fù)氧后Notch信號(hào)途徑相關(guān)分子的變化,以及Notch信號(hào)途徑是否影響ROS的生成。為探索MI/R損傷的分子調(diào)控機(jī)制,及為缺血性心臟病的防

7、治提供一個(gè)嶄新的策略和途徑。
　　【方法】
　　1.H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞近匯合時(shí),用2.5 g/L胰酶消化,將H9C2(2-1)細(xì)胞按1:2～1:4傳代。在實(shí)驗(yàn)前1 d,細(xì)胞培養(yǎng)換為含20 ml/L胎牛血清的培養(yǎng)基,使H9C2(2-1)細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。
　　2.原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)無(wú)菌條件下取出1～3 d的SD乳鼠心臟,剪碎,加入含

8、1.0 g/L膠原酶Ⅰ的消化液,于37℃水浴3～5 min,反復(fù)吹打,靜置,棄去上清液。于沉淀中再加入消化液,置37℃水浴中約5 min,反復(fù)吹打后,將上清移至含100 ml/L胎牛血清及0.1 mmol Brdu的完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清100U/ml青霉素及0.1mg/ml鏈霉素的DMEM)中。重復(fù)上述步驟,直至所有組織都被完全消化。離心取沉淀并重懸于完全培養(yǎng)基中。差速貼壁90~120 min,將細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中,加

9、入含0.1 mmol/L Brdu的完全培養(yǎng)基。每24 h換1次液。換液時(shí),觀察細(xì)胞形態(tài),若由圓形變成梭形或不規(guī)則形,由靜止變成有規(guī)律的收縮時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組將心肌細(xì)胞分為兩個(gè)組,即缺氧/復(fù)氧(H/R)組和常氧組。H/R組的細(xì)胞用無(wú)糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于低氧罐中培養(yǎng)6 h,隨后換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h,常氧組的細(xì)胞使用含100 ml/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩組又分為對(duì)照組、DMSO組及GSI(

10、Notch信號(hào)阻斷劑)組。
　　4.體外應(yīng)用GSI阻斷Notch信號(hào)在心肌細(xì)胞缺氧處理前一天加GSI75μmol/L按1:3000溶于完全培養(yǎng)基中。觀察阻斷Notch信號(hào)途徑對(duì)MI/R損傷的影響。
　　5.利用Real-time PCR檢測(cè)Notch信號(hào)途徑相關(guān)分子mRNA的表達(dá)水平應(yīng)用 RNA提取試劑盒提取乳鼠原代心肌細(xì)胞總 RNA,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為2×qPCR TaqMix12.5μl、1

11、0μmol/L擴(kuò)增Notch1、Jagged1、Hes1基因的正反向引物序列的混合物0.5μl,對(duì)應(yīng)的cDNA各1μl,補(bǔ)加水至25μl,并設(shè)不加模板的陰性對(duì)照(2×qPCR TaqMix12.5μl、10μmol/L擴(kuò)增Notch1、Jagged1、Hes1基因的正反向引物序列的混合物0.5μl,補(bǔ)加水至25μl)。用熒光定量PCR儀擴(kuò)增,PCR的反應(yīng)條件為:95℃5 min預(yù)變性后,95℃15 s→60℃35 s(熒光檢測(cè)),共40

12、個(gè)循環(huán)。并對(duì)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行了電泳分析。
　　6.Notch信號(hào)途徑相關(guān)分子的Western blot檢測(cè)從培養(yǎng)的乳鼠原代心肌細(xì)胞中提取蛋白,測(cè)定蛋白濃度后,進(jìn)行 SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至聚偏[二]氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂奶粉封閉1 h。加1:500兔抗Notch1、1:200山羊抗Hes1或1:1000小鼠抗β-Tubulin抗體,4℃孵育過(guò)夜,用TBST洗膜,再分別用1:4000的HPR標(biāo)記山羊抗兔、?？股窖?/p>

13、及山羊抗小鼠IgG,于37℃孵育1 h。洗滌后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯色后,采用Quantity One分析軟件進(jìn)行信號(hào)采集并進(jìn)行灰度掃描。
　　7.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)將H9C2(2-1)細(xì)胞接種到蓋玻片上,低氧/復(fù)氧結(jié)束后,嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞染色,并用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為:凋亡細(xì)胞呈綠色,表示凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,藍(lán)色為細(xì)胞核。觀察凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù),用400倍顯微鏡觀察每張玻璃片中凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù),每

14、張玻片隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每組計(jì)數(shù)100個(gè)視野,結(jié)果以其均值表示。凋亡指數(shù)(AI)為凋亡細(xì)胞的數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)(細(xì)胞總數(shù))的百分比表示。染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)均采用雙盲法。
　　8.ROS水平的熒光探針DCFH-DA檢測(cè)采用胰酶消化的貼壁H9C2(2-1)細(xì)胞。將探針溶液在新的DMEM培養(yǎng)基中稀釋到所需濃度作為染色液,以染色液更換細(xì)胞培養(yǎng)液,在37℃避光孵育20 min(每隔5 min搖動(dòng)細(xì)胞)。孵育結(jié)束后,用新鮮DMEM培養(yǎng)基

15、洗滌細(xì)胞。加0.5~1 ml冰冷PBS的重懸細(xì)胞(5~10萬(wàn)個(gè)),采用流式細(xì)胞儀于488 nm波長(zhǎng)激發(fā),測(cè)定波長(zhǎng)大于525 nm的發(fā)射光,可將細(xì)胞分成兩個(gè)亞群:ROS陰性的細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度;ROS陽(yáng)性的細(xì)胞具有較強(qiáng)的熒光。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以x±s表示,用origin8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用ANOVA,兩組間差異比較采用組間t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【結(jié)果】
　　1.阻斷N

16、otch信號(hào)途徑會(huì)導(dǎo)致MI/R損傷加重。用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,用LDH檢測(cè)細(xì)胞損傷,體外結(jié)果顯示H/R顯著增加心肌細(xì)胞凋亡率和心肌損傷,應(yīng)用GSI阻斷Notch信號(hào)途徑后心肌細(xì)胞凋亡率和損傷水平進(jìn)一步增加。
　　2.阻斷Notch信號(hào)途徑可使MI/R損傷中心肌細(xì)胞的ROS水平增加。用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)心肌細(xì)胞ROS水平,體外結(jié)果顯示H/R使心肌細(xì)胞ROS水平顯著增加,應(yīng)用GSI阻斷Notch信號(hào)途徑后進(jìn)一步促

17、進(jìn)H/R心肌細(xì)胞ROS的生成。
　　3.MI/R損傷時(shí)Notch信號(hào)途徑中各分子的基因表達(dá)反應(yīng)性上調(diào)。H/R可使心肌細(xì)胞中Notch信號(hào)途徑的受體基因Notch1的水平及心肌細(xì)胞中配體基因Jagged1的水平顯著升高,加入GSI后,受體Notch基因和配體Jagged1基因的水平,并沒(méi)有顯著改變。H/R可使心肌細(xì)胞中Notch信號(hào)途徑下游轉(zhuǎn)錄基因Hes1的水平顯著升高,加入GSI后,可顯著降低Hes1基因的水平。
　　4.M

18、I/R損傷時(shí) Notch信號(hào)途徑中蛋白水平的表達(dá)反應(yīng)性上調(diào)。體外結(jié)果顯示H/R可顯著增加NICD1和Notch信號(hào)下游轉(zhuǎn)錄因子Hes1的蛋白表達(dá)水平;加入GSI后,并未影響NICD1的蛋白水平,但Hes1的蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制,顯著下降。
　　5.應(yīng)用H9C2(2-1)細(xì)胞分別與OP9-Dll1或OP9-GFP共培養(yǎng)的方法,激活Notch信號(hào)途徑,熒光探針DCFH-DA檢測(cè)法和細(xì)胞流示圖觀察心肌細(xì)胞中ROS的水平。結(jié)果顯示,激

19、活Notch信號(hào)途徑組:OP9-Dll1與對(duì)照組:OP9-GFP相比較,H/R后OP9-Dll1組心肌細(xì)胞中ROS的水平顯著降低,說(shuō)明激活Notch信號(hào)途徑可能抑制ROS的生成。
　　6.LDH細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示心肌細(xì)胞損傷水平:H/R組細(xì)胞損傷水平明顯比常氧組多。給予GSI抑制Notch信號(hào)途徑后,可進(jìn)一步加重H/R導(dǎo)致的心肌損傷;給予NAC清除ROS,H/R后細(xì)胞損傷水平顯著降低。說(shuō)明Notch信號(hào)途徑是通過(guò)抑制ROS生成,

20、來(lái)降低H/R后細(xì)胞損傷。
　　總之,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了H/R心肌細(xì)胞中Notch信號(hào)途徑分子表達(dá)的水平,觀察了抑制Notch信號(hào)途徑對(duì)Notch信號(hào)分子的表達(dá),提示Notch信號(hào)途徑在MI/R時(shí)反應(yīng)性的上調(diào),可能是細(xì)胞的代償性保護(hù)反應(yīng)。進(jìn)一步檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平的變化,發(fā)現(xiàn)H/R時(shí)可顯著提高心肌細(xì)胞凋亡的水平,并在給予GSI阻斷Notch信號(hào)途徑后細(xì)胞凋亡的水平進(jìn)一步增加,間接說(shuō)明 Notch信號(hào)途徑可能對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用。進(jìn)一步研

21、究發(fā)現(xiàn),給予GSI后,通過(guò)抑制Notch信號(hào)途徑可增加H/R心肌細(xì)胞中 ROS的生成,并導(dǎo)致細(xì)胞損傷。激活 Notch信號(hào)途徑,ROS的生成降低。給予NAC后,通過(guò)清除ROS,可減少細(xì)胞損傷。該結(jié)果說(shuō)明,激活Notch信號(hào)途徑,可能通過(guò)抑制ROS生成降低MI/R損傷。
　　【結(jié)論】
　　1.Notch信號(hào)阻斷后會(huì)引起心肌缺血/再灌注損傷加重,表明Notch信號(hào)途徑在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。抑制Notch信號(hào)途