TAT修飾的小鼠和人IFNγ的制備及功能鑒定.pdf

1、干擾素γ(Interferongamma,IFNγ)具有抗腫瘤和抗病毒等活性，但血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)能阻礙其進(jìn)入腦組織，因而限制了IFNγ在腦部腫瘤和腦部病毒感染治療中的應(yīng)用。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomains，PTD)是HIVI反式激活因子(TAT)的一小段多肽，當(dāng)TATPTD與蛋白融合后能促進(jìn)其高效跨越包括BBB、細(xì)胞膜和皮膚等在內(nèi)的多種膜結(jié)構(gòu)。而且，TATPTD的分

2、子量小，無細(xì)胞毒性，免疫原性極低，不影響融合的蛋白功能。因此，TAT與IFNγ融合后有望使IFNγ獲得了跨越BBB的能力而用于腦部腫瘤和腦部病毒感染等疾病的治療。為此，本實(shí)驗(yàn)首先克隆了編碼小鼠與人IFNγ(mIFNγ和huIFNγ)及相應(yīng)TAT修飾的IFNγ(IFNγ-TAT)的cDNA，然后將其構(gòu)建于pQE-80L表達(dá)載體，進(jìn)而行蛋白表達(dá)與純化；采用MTT法和BrdU-ELISA體外鑒定重組蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力；免疫組化法鑒定重

3、組蛋白進(jìn)入細(xì)胞的能力；采用ELISA法測定SD大鼠腦脊液中小鼠IFNγ-TAT(mIFNγ-TAT)濃度，從而鑒定其跨BBB的能力。取得的主要研究結(jié)果和結(jié)論如下： 1.克隆了編碼mIFNγ和huIFNγ的cDNA，所得序列與GenBank中mIFNγ和huIFNγcDNA的序列完全一致。 2.構(gòu)建了mIFNγ-TAT和huIFNγ-TATcDNA，克隆于pUC19質(zhì)粒。 3.將上述各DNA分別克隆于pQE-80L

4、表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，mIFNγ、mIFNγ-TAT、huIFNγ和huIFNγ-TAT蛋白均獲得了較高水平的表達(dá)。mIFNγ、mIFNγ-TAT、huIFNγ和huIFNγ-TAT蛋白的相對分子量分別為1.6×104、1.7×104、1.7×104和1.8×104。針對mIFNγ和mIFNγ-TAT優(yōu)化表達(dá)參數(shù)為1mmol/L的IPTG在30℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。而針對huIFNγ和huIFNγ-TAT優(yōu)化

5、表達(dá)參數(shù)為1mmol/L的IPTG在35℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。mIFNγ、mIFNγ-TAT和huIFNγ蛋白主要以可溶性形式存在，huIFNγ-TAT蛋白主要是以包涵體的形式存在。 4.經(jīng)Ni2+-NTA親和層析系統(tǒng)純化后，各重組蛋白均達(dá)到了較高的純度，純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。 5.生物學(xué)活性分析表明，mIFNγ和mIFNγ-TAT能在體外抑制小鼠H22細(xì)胞增殖；huIFNγ和huIFNγ-TAT可在體外顯

6、著抑制人Raji細(xì)胞增殖。 6.免疫組化分析結(jié)果顯示，mIFNγ-TAT較mIFNγ更易進(jìn)入小鼠H22細(xì)胞，huIFNγ-TAT較huIFNγ蛋白更易進(jìn)入Raji細(xì)胞。 7.與mIFNγ比較，mIFNγ-TAT具有顯著的跨越BBB的能力。 總之，本研究成功制備了mIFNγ、mIFNγ-TAT、huIFNγ和huIFNγ-TAT蛋白，功能實(shí)驗(yàn)表明，TATPTD修飾可在體外增強(qiáng)IFNγ進(jìn)入細(xì)胞的能力，能在體內(nèi)促進(jìn)mI