轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠和豬的制備及基因功能研究.pdf

1、繁殖性狀是影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，其中產(chǎn)仔數(shù)是衡量母豬繁殖性狀的一個(gè)重要指標(biāo)。提高產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵在于降低豬胚胎/胎兒死亡率，提高胎兒存活率。而胚胎死亡絕大多數(shù)發(fā)生在胚胎附植前或附植期間，因此胚胎附植是影響母豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵時(shí)期。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子HOXA10基因（同源異形框A10基因）受雌激素、孕激素調(diào)控，高表達(dá)于著床窗口期，對(duì)胚胎附植的建立、妊娠的維持等具有重要作用。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備特定時(shí)期在特異組織中高表達(dá)HOXA10基因的轉(zhuǎn)

2、基因動(dòng)物，降低胚胎死亡，提高產(chǎn)仔數(shù)是我們努力的目標(biāo)。
　　本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠模型積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為制備高繁殖力轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ);通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)，以期獲得高繁殖潛力的轉(zhuǎn)基因克隆豬，獲取新的科研材料;深入了解HOXA10基因在胚胎發(fā)育和附植過(guò)程中的調(diào)控機(jī)理，對(duì)于提高母豬產(chǎn)仔數(shù)具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　本研究主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用顯微注射法制備轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠，通過(guò)Southern及外源插入片段的全

3、長(zhǎng)擴(kuò)增對(duì)G0代陽(yáng)性小鼠進(jìn)行鑒定。對(duì)G2代陽(yáng)性小鼠的各組織中Hoxa10基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在腎臟、膀胱和子宮內(nèi)膜組織中有表達(dá)，在心臟、脾臟和卵巢中有痕量表達(dá)。G2代母鼠腹腔注射雌激素、孕激素來(lái)誘導(dǎo)Hoxa10基因表達(dá)，使用Q-PCR及Westernblot檢測(cè)Hoxa10表達(dá)的差異，并用Q-PCR檢測(cè)受Hoxa10調(diào)控的下游基因:ETA（內(nèi)皮素受體A）和Phgdh（磷酸甘油酸脫氫酶），發(fā)現(xiàn)這些基因在轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)具

4、有差異。統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)產(chǎn)胎次的G2代小鼠產(chǎn)仔數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠比非轉(zhuǎn)基因小鼠提高產(chǎn)仔數(shù)約1只(P=0.08)，可以認(rèn)為轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠的產(chǎn)仔數(shù)有增加的趨勢(shì)。
　　2.對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的6頭G0代轉(zhuǎn)HOXA10基因克隆公豬進(jìn)行傳代，產(chǎn)生了56頭G1代小豬，經(jīng)檢測(cè)有25頭為陽(yáng)性，其中11頭雌性。檢測(cè)G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬12個(gè)組織中HOXA10的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:HOXA10基因在腎臟、大腸和膀胱中的表達(dá)較高;肌肉和淋巴有微弱表達(dá);

5、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、脂肪、小腸和睪丸中未檢測(cè)到表達(dá)。
　　3.對(duì)4頭G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬及部分G1代豬（陽(yáng)性和陰性）進(jìn)行血液生理生化指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬及G1代公豬（陽(yáng)性與陰性）血小板數(shù)目均低于非轉(zhuǎn)基因公豬和文獻(xiàn)報(bào)道的血小板數(shù)目。生化指標(biāo)中，G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬的睪酮含量低于非轉(zhuǎn)基因公豬，其它指標(biāo)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常。
　　4.通過(guò)對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pc3.1-PF3-HOXA10表達(dá)載

6、體、G418篩選、單克隆挑選、PCR檢測(cè)，建立了4株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HOXA10的陽(yáng)性細(xì)胞系。
　　5.利用胚胎移植技術(shù)，核移植其中1株生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞，成功制備了3頭轉(zhuǎn)HOXA10基因克隆母豬。采用Q-PCR和染色體步移技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆母豬的外源基因拷貝數(shù)及整合位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3頭豬的拷貝數(shù)分別為27.70、19.88、25.26，外源片段可能插入到4號(hào)、9號(hào)、13號(hào)、14號(hào)染色體上。
　　6.采用LncRNA芯片，分析在Is

7、hikawa細(xì)胞（子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株）中過(guò)表達(dá)HOXA10基因后，引起差異表達(dá)的mRNA和LncRNA。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HOXA10基因后，有339個(gè)mRNA上調(diào)表達(dá)，568個(gè)mRNA下調(diào)表達(dá)(FoldChange≥2，P＜0.05及Q＜0.05)。對(duì)過(guò)表達(dá)HOXA10基因后差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的mRNA主要參與血管發(fā)育、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移等生物過(guò)程;下調(diào)表達(dá)的mRNA主要參與細(xì)胞周期、胞內(nèi)運(yùn)輸、蛋白核定位等生物過(guò)程。進(jìn)

8、行KEGG通路分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞周期等生物學(xué)通路。
　　7.對(duì)LncRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HOXA10基因后，引起732個(gè)LncRNA上調(diào)表達(dá)，294個(gè)LncRNA下調(diào)表達(dá)（FoldChange≥2，P＜0.05及Q＜0.05）。對(duì)全部LncRNA進(jìn)行亞組分析，共檢測(cè)到1，514條類(lèi)似增強(qiáng)子的LncRNA，其中有43條上調(diào)表達(dá)，16條下調(diào)表達(dá)。在9，987條基因問(wèn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA中，有274條上