轉(zhuǎn)雙基因(pGH+IGF--I)豬的制備及檢測(cè).pdf

1、StudyonPreparationandDetectionofTransgenicDoubleGenes(pGHandIGFI)PigsThesissubmittedtoOjngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyYaoYalnzhu(CollegeofAnimalScienceandTechnology

2、)Supervisor：ProfSunJinhaiQingdaoChinaJune，2014青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要轉(zhuǎn)雙基因(pGHIGFI)豬的制備及檢測(cè)摘要?jiǎng)游锷L(zhǎng)激素軸在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育中有重要作用，其中下丘腦生長(zhǎng)激素(GH)胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGFI)軸與動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育有密切關(guān)系，GH和IGFI均可獨(dú)立亦可共同促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來，國(guó)內(nèi)外許多試驗(yàn)證明pGH和IGFI均能有效的促進(jìn)豬的生長(zhǎng)，提高瘦肉率，降低飼養(yǎng)成本。本

3、研究旨在構(gòu)建可高效轉(zhuǎn)移pGH基因和IGFI基因的雙基因真核表達(dá)載體，制備轉(zhuǎn)雙基因(pGHIGFI)豬，以期探索pGH基因和IGFI基因?qū)ωi生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為節(jié)糧型高瘦肉率豬新品種的培育奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。首先從長(zhǎng)白豬耳樣中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)獲得pGH基因和IGFI基因CDS序列，克隆至pcDNA31()載體，構(gòu)建pcDNA3I()pGH1GFIX叉基因重組真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后，轉(zhuǎn)染到PKl5細(xì)胞，驗(yàn)證其

4、表達(dá)情況。結(jié)果表明，熒光定量PCR(QPCR)檢測(cè)雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PKl5細(xì)胞中pGHmRNA和IGFImRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。本研究成功構(gòu)建的pcDNA31()pGH1GFI基因真核表達(dá)載體在PKl5細(xì)胞中成功表達(dá)，為下一步轉(zhuǎn)雙基因豬的制備及研究奠定了基礎(chǔ)。將構(gòu)建的pcDNA31()pGHIGFIx叉基因重組真核表達(dá)載體用納米材料包裹后轉(zhuǎn)染長(zhǎng)白豬精子，通過人工授精導(dǎo)入受體母豬。待其產(chǎn)仔后，采取仔豬耳樣

5、，提取DNA，應(yīng)用PCR及測(cè)序鑒定轉(zhuǎn)雙基因陽(yáng)性個(gè)體。在陽(yáng)性個(gè)體17月齡進(jìn)行所轉(zhuǎn)外源基因的跟蹤檢測(cè)，并對(duì)外源雙基因的穩(wěn)定遺傳可能性進(jìn)行鑒定。結(jié)果母豬妊娠獲得13頭仔豬，其中11頭健仔，1頭死胎和1頭畸形。經(jīng)PCR及測(cè)序檢測(cè)其中4頭仔豬為轉(zhuǎn)雙基因豬，轉(zhuǎn)雙基因陽(yáng)性率為3076％。QPCR檢測(cè)外源pGH基因與IGFI基因在轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)成功表達(dá)。17月齡均可檢測(cè)到外源pGH基因與1GFI基因，證明兩個(gè)外源基因在轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)穩(wěn)定存在，并未隨著生