LMP1轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建及功能初步研究.pdf

1、本研究擬利用本室以ED-L2為啟動(dòng)子構(gòu)建的LMP1基因慢病毒表達(dá)載體：ED-L2-B-LMP1-EGFP和ED-L2-N-LMP1-EGFP，分別以慢病毒感染技術(shù)和目的基因顯微注射技術(shù)構(gòu)建B-LMP1和N-LMP1轉(zhuǎn)基因小鼠。這兩個(gè)載體是分別包含全長N-LMP1基因和B95-8-LMP1基因的慢病毒載體，經(jīng)驗(yàn)證，載體攜帶的LMP1和EGFP融合蛋白可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中正確表達(dá)。本研究在建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基礎(chǔ)上，對轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞生長和增殖的相關(guān)

2、因子進(jìn)行檢測，探討LMP1基因?qū)?xì)胞生長和增殖相關(guān)蛋白的影響，揭示LMP1在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，為建立鼻咽癌相關(guān)動(dòng)物模型奠定研究基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容包括： 1.鑒定ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒載體、獲得病毒和目的片段； 2.比較不同品系小鼠用于胚胎移植異同，尋找合適的候選轉(zhuǎn)基因小鼠品系； 3.慢病毒感染法和精原核顯微注射法分別建立LMP1轉(zhuǎn)基因小鼠； 4.比較轉(zhuǎn)基因小鼠和正常對照小鼠PCNA、

3、TGF-a、EGF和EGFR表達(dá)的異同。 方法1.ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒表達(dá)載體酶切鑒定，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞觀察熒光表達(dá)，收獲pED-L2-B-LMP1-EGFP病毒； 2.分別以KM小鼠與B6CF1(C57BL/6雌鼠和BALB/C雄鼠雜交F1代)小鼠作為受體鼠和供體鼠，分析比較其胚胎移植成功率的差異； 3.采用ED-L2-B-LMP1-EGFP慢病毒受精卵透明帶內(nèi)注射和注射后受精卵回種技術(shù)，建立

4、ED-L2-B-LMP1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠； 4.分別應(yīng)用ED-L2-B-LMP1-EGFP和ED-L2-N-LMP1目的DNA顯微注射及受精卵回種技術(shù)，建立ED-L2-B-LMP1-EGFP和ED-L2-N-LMP1轉(zhuǎn)基因小鼠； 5.應(yīng)用PCR、SouthernBlot、免疫組化和組織染色技術(shù)及PCR產(chǎn)物測序，鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因的整合效果； 6.應(yīng)用免疫組化檢測和分析轉(zhuǎn)基因小鼠的PCNA，TGF-a，EG

5、F和EGFR表達(dá)情況。 結(jié)果 1.ED-L2-N-LMP1-EGFP慢病毒載體酶切鑒定 1.1重組ED-L2-N-LMP1-EGFP慢病毒載體經(jīng)PacI/BamHI雙酶切后，可見8687bp的載體片段(包含EGFP片段)、3600bp的LMP1片段及782bp的ED-L2啟動(dòng)子片段，和理論上各條帶大小一致； 1.2載體質(zhì)粒經(jīng)PacI/EcoRI雙酶切，獲得7968bp載體片段(不包含ED-L2和EGFP片

6、段)和ED-L2-N-LMP1-EGFP目的片段(5101bp)； 1.3載體質(zhì)粒經(jīng)PacI/KpnI雙酶切，獲得三條帶，分別為7887bp載體片段(不包含EGFP片段)、ED-L2-N-LMP1目的片段(4382bp)和EGFP(約800bp)；膠回收純化ED-L2-N-LMP1片段，-20℃保存用于轉(zhuǎn)基因顯微注射。 2.重組ED-L2-B-LMP1-EGFP慢病毒載體酶切鑒定 2.1載體PacI/BamHI酶

7、切鑒定，可見8687bp載體、1300bpB-LMP1和782bpED-L2片段； 2.2PacI/EcoRI雙酶鑒定獲得7968bp載體片段和2801bpEDL-2-B-LMP1-EGFP片段； 3.ED-L2-N-LMP1-EGFP和ED-L2-B-LMP1-EGFP質(zhì)粒分別載體轉(zhuǎn)染293FT包裝細(xì)胞，48h后倒置熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)。 4.對小鼠品系比較顯示，B6CF1小鼠作為供體鼠和受體

8、鼠的胚胎移植成功產(chǎn)仔率明顯高于KM鼠； 5.慢病毒感染技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果：對412枚受精卵注射帶目的基因ED-L2-B-LMP1-EGFP的慢病毒，回種226枚，共移植入19只假孕鼠，5只回種假孕鼠產(chǎn)仔，共產(chǎn)仔16個(gè)，即受體鼠產(chǎn)仔率為26％，受精卵回種產(chǎn)仔率為7％； 6.精原核顯微注射技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果：用ED-L2-B-LMP1-EGFP目的片段注射受精卵874枚，回種卵545枚，共移植入41只假孕鼠，9只回種

9、假孕鼠產(chǎn)仔，共產(chǎn)仔35個(gè)，即受體鼠產(chǎn)仔率為22％，受精卵回種產(chǎn)仔率為6％；用ED-L2-N-LMP目的片段注射受精卵224枚，回種卵146枚，共移植入9只假孕鼠，3只回種假孕鼠產(chǎn)仔，共產(chǎn)仔25個(gè)，即受體鼠產(chǎn)仔率為33％，受精卵回種產(chǎn)仔率為17％。 7.PCR、SouthernBlot、免疫組化和組織染色技術(shù)結(jié)合PCR產(chǎn)物測序，鑒定證明慢病毒感染法建立1只ED-L2-B-LMP1-EGFP轉(zhuǎn)基因陽性小鼠；DNA顯微注射技術(shù)建立4只

10、ED-L2-B-LMP1-EGFP轉(zhuǎn)基因首建鼠(陽性率為11％)，其F1代ED-L2-B-LMP1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠有2只LMP1基因陽性，而且SouthernBlot陽性小鼠LMP1基因表達(dá)也為陽性，主要呈上皮定位，表達(dá)部位包括鼻咽部上皮、皮膚表皮、胃腸道柱狀上皮、腎臟小管上皮、腮腺上皮細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞，肝臟則以少量枯否氏細(xì)胞和少量肝細(xì)胞散在陽性。轉(zhuǎn)基因小鼠鼻咽部鱗狀上皮細(xì)胞層數(shù)增加，主要表現(xiàn)為基底細(xì)胞及棘細(xì)胞增生，上皮腳

11、下延，基底細(xì)胞及基底上棘細(xì)胞輕度異型。25只ED-L2-N-LMP1F0代轉(zhuǎn)基因小鼠有12只為PCR陽性，免疫組化顯示其LMP1表達(dá)與ED-L2-B-LMP1-EGFP轉(zhuǎn)基因定位基本一致。 8.免疫組化檢測B-LMP1轉(zhuǎn)基因小鼠的PCNA，TGF-a、EGF和EGFR表達(dá)顯示，與對照小鼠比較，轉(zhuǎn)基因小鼠的PCNA表達(dá)強(qiáng)于對照小鼠；而TGF-a、EGF和EGFR基本上僅在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá)，對照小鼠體內(nèi)該三種蛋白基本上沒有表達(dá)或僅