黑青斑河鲀干擾素γ(IFNγ)的克隆鑒定和功能初步研究.pdf

1、干擾素γ（Interferon γ），作為干擾素系統(tǒng)中重要的Ⅱ型IFN，是由Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是主要的巨噬細(xì)胞刺激因子，它對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)有多方面的調(diào)節(jié)作用，能激活效應(yīng)細(xì)胞，提高自然殺傷細(xì)胞（NK）、巨噬細(xì)胞活性，促進(jìn)Ig的轉(zhuǎn)換，具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用。本研究利用黑青斑河鲀基因組數(shù)據(jù)庫(kù)豐富的序列信息結(jié)合分子生物學(xué)的方法，克隆了黑青斑河鲀IFNγ1和IFNγ2基因的ORF序列，并對(duì)其分別進(jìn)行了序列特征分析和

2、同源性比對(duì)，了解黑青斑河鲀IFNγ1和IFNγ2與其他脊椎動(dòng)物的IFNγ結(jié)構(gòu)異同及進(jìn)化關(guān)系；同時(shí)我們對(duì)IFNγ1和IFNγ2在各組織的分布情況進(jìn)行了RT—PCR半定量分析，以了解其表達(dá)模式；然后，我們利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)IFNγ1和IFNγ2分別進(jìn)行了融合蛋白表達(dá)，并純化出重組蛋白；通過(guò)頭腎細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)鑒定了所得到重組蛋白的活性，并利用得到的重組蛋白刺激頭腎細(xì)胞，檢測(cè)IFNγ下游信號(hào)通路中多個(gè)因子的表達(dá)水平的變化情況以對(duì)所得到的重

3、組蛋白的功能進(jìn)行初步的探討。本研究主要內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.本研究克隆得到的黑青斑河鲀IFNγ1基因ORF長(zhǎng)為540bp，編碼一段179個(gè)氨基酸、分子量大小約為22.5kDa的前體蛋白。黑青斑河鲀IFNγ2基因ORF長(zhǎng)為567bp，編碼一段長(zhǎng)188個(gè)氨基酸，分子量大小約為23.9kDa的前體蛋白。序列分析表明它們基因結(jié)構(gòu)、序列特征及保守結(jié)構(gòu)與已發(fā)現(xiàn)鑒定的其他物種IFNγ基因都較為相似。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)IFNγ2與紅鰭東方鮑

4、IFNγ最為接近，而在魚類中新發(fā)現(xiàn)的IFNγ1與斑馬魚、鯰魚以及草魚的IFNγ1一致性都比較低，且與其自身的IFNγ2的一致性也很低。采用半定量RT—PCR技術(shù)研究IFNγ1和IFNγ2基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明，黑青斑河鲀IFNγ2基因在所檢測(cè)的各組織中廣泛表達(dá)，而IFNγ1基因僅在腸組織中檢測(cè)到低水平的表達(dá)，這與IFNγ2基因的表達(dá)模式差異較大。 2.利用已經(jīng)克隆得到的IFNγ1和IFNγ2ORF序列，設(shè)計(jì)酶切引物，將其擴(kuò)增并

5、連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件進(jìn)行表達(dá)，得到了大量的以包涵體形式存在的IFNγ1重組蛋白和適量的IFNγ2重組蛋白。在優(yōu)化表達(dá)條件未能促進(jìn)可溶性的情況下，我們對(duì)包涵體IFNγ1進(jìn)行了純化、變性和復(fù)性，獲得了重組蛋白IFNγ1。 3.利用得到的不同濃度的黑青斑河鲀IFNγ1重組蛋白刺激黑青斑河鲀的頭腎細(xì)胞，以檢測(cè)其對(duì)頭腎細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果顯示，頭腎細(xì)胞增殖程度隨重組蛋白濃度的增加而增加。同時(shí)，我們對(duì)刺激后的頭腎