HIV-1 Tat新型免疫原的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、艾滋病是由HIV感染引起的嚴(yán)重威脅人類健康和社會穩(wěn)定的傳染病之一。為避免更多的人感染HIV，降低感染者的發(fā)病率，研制有效的HIV疫苗成為HIV防治的重要手段之一。 本研究分以下四部分進(jìn)行： 一、HIV-1型HXB2株Tat蛋白在大腸桿菌中的分段表達(dá) 為了分析新型Tat免疫原所誘導(dǎo)的抗體譜分布特點，我們對全長Tat及其各功能區(qū)(N端區(qū)(1-21aa)、半胱氨酸富集區(qū)(22-37aa)、核心區(qū)(38-48aa)、堿性

2、氨基酸富集區(qū)(49-57aa)、谷氨酰胺富集區(qū)(60-72aa)以及C端區(qū)(73-101aa))分段進(jìn)行原核表達(dá)。具體為：PCR方法獲得tat(1-101aa)、tat(1-48aa)、tat(22-72aa)、tat(38-101aa)、tat(49-101aa)和tat(60-101aa)片段，T/A克隆法將其克隆到pMD18-T載體進(jìn)行測序。將驗證正確的序列分別克隆到原核表達(dá)載體pPEPTIDE中構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒；將各表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)

3、入E．coli BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出Tat(1-101aa)、Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)、Tat(38-101 aa)、Tat(49-101aa)、Tat(60-101aa)、融合蛋白；Ni-NTA親和層析法純化出上述表達(dá)蛋白。 二、HIV-1型HXB2株Tat(B41-101N)，Tat(B41-101C)兩種融合蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析 研究表明：Tat蛋白堿性區(qū)(49-

4、57aa)介導(dǎo)Tat蛋白穿膜，與Tat細(xì)胞外活性密切相關(guān)，Tat的C端(73-101aa)包含重要的RGD模序，與Tat的“毒性”作用(如誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生)高度相關(guān)。我們分別將Tat的41.101aa置于天然Tat1-101aa的N端前構(gòu)建Tat(B41-101N)新型免疫原和將Tat的41-101aa置換天然Tat1-101aa的N表位(1-21aa)構(gòu)建Tat(B41-101C)新型免疫原，以期誘導(dǎo)出高滴度的針對堿性區(qū)和C末端區(qū)的

5、中和抗體。 根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子優(yōu)化后的HIV-1型HXB2株Tat DNA序列設(shè)計引物，用重疊延伸PCR方法合成HIV-1 tat(B41-101N)和tat(B41-101C)序列，T/A克隆法將其克隆到pMD18-T載體進(jìn)行測序。將測序正確的tat(B41-101N)和tat(B41-101C)克隆至原核表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-tat(B41-101N)和pET32a-tat(B41-101

6、C)。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E．coli BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出相對分子量分別為36000，34000的融合蛋白，并用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白。用本實驗室獨立制備的小鼠特異性抗Tat單克隆抗體進(jìn)行的Western-blot鑒定證實Tat(B41-101N)和Tat(B41-101C)與該單克隆抗體均呈特異性反應(yīng)。用Tat(B41-101N)、Tat(B41-101C)、天然Tat分別免疫家兔，制備其抗血清，ELISA

7、分析顯示3種Tat免疫原均誘導(dǎo)出特異的Tat抗血清。表位分析結(jié)果顯示：(1)針對Tat(1-48aa)，僅天然Tat誘導(dǎo)出較高的抗血清，Tat(B41-101N)和Tat(B41-101C)均不能有效誘導(dǎo)出其抗血清，提示針對Tat(1-48)表位抗體的誘導(dǎo)依賴于天然Tat的構(gòu)象；(2)三種免疫原誘導(dǎo)的抗血清與Tat(22-72aa)反應(yīng)均較強，提示Tat(22-72aa)是Tat較穩(wěn)定的表位；(3)Tat(B41-101C)誘導(dǎo)出相對于

8、天然Tat明顯增強的針對C端肽段Tat(49-101aa)和Tat(60-101aa)的抗體，提示Tat(B41-101C)具有與天然Tat不同的免疫原性；(4)Tat(B41-101C)與Tat(B41-101N)相比，提高了對Tat(49-101aa)和Tat(60-101aa)C端區(qū)的反應(yīng)性，提示N端序列可能對Tat誘導(dǎo)C末端抗體具有抑制作用。 三、其它新型Tat免疫原產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答分析 為了進(jìn)一步了解Tat免

9、疫原特性，篩選最佳候選疫苗，除以上兩種改造外，本課題組還設(shè)計了其它的Tat新型免疫原，分別為：①由于Cys-rich區(qū)易形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵影響Tat穩(wěn)定性，我們將Cys-rich區(qū)22-37位氨基酸缺失構(gòu)建了新的免疫原，命名為Tatqs；②由于Cys-rich的自佐劑作用，為了驗證該作用是否受Cys-rich位置影響，我們分別將Cys-rich區(qū)置于N端前構(gòu)建TatCN，將Cys-rich區(qū)置于C末端后構(gòu)建TatCC；③為了進(jìn)一步

10、驗證N端序列對Tat誘導(dǎo)C末端抗體具有抑制作用和提高C末端誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度，我們構(gòu)建了缺失N端序列的以第一外顯子為主的Tat(22-72aa)和以C端表位為主的Tat(38-101aa)。 將上述多種Tat新型免疫原與天然Tat分別免疫新西蘭兔，制備其抗血清。對各免疫原所誘導(dǎo)的兔抗血清ELISA分析顯示：(1)各免疫原均能誘導(dǎo)出針對全長Tat的特異抗體，但抗體滴度有較大的差別：Tat(B41-101C)所誘導(dǎo)抗血清滴度最高，T

11、at和Tat(22-72aa)次之，TatCN最低；(2)針對Tat(1-48aa)的反應(yīng)，與第二部分結(jié)果類似，僅天然Tat誘導(dǎo)出較高的抗血清，而所有改造過的Tat免疫原均不能有效誘導(dǎo)出其抗血清，提示針對Tat(1-48)表位抗體的誘導(dǎo)依賴于天然Tat的構(gòu)象；(3)與第二部分結(jié)果類似，所有免疫原所誘導(dǎo)的抗血清與Tat(22-72aa)反應(yīng)均較強，提示Tat(22-72aa)是Tat較穩(wěn)定的表位；(4)Tat(B41-101C)、Tat(

12、38-101aa)和TatCC分別誘導(dǎo)出相對于天然Tat明顯增強的針對C端肽段的抗體，其中Tat(B41-101C)和Tat(38-101aa)顯著提高了針對C端Tat(49-101aa)和Tat(60-101aa)抗體的產(chǎn)生，TatCC顯著提高了針對C端Tat(38-101aa)抗體的產(chǎn)生(均高于其他所有免疫原)，進(jìn)一步提示經(jīng)改造的抗原可以產(chǎn)生與天然Tat不同的免疫原性，有利于對Tat疫苗的改進(jìn)；(5)缺失N端的Tat(B41-101

13、C)和Tat(38-101aa)誘導(dǎo)的針對C端的抗體均顯著高于包含N端的Tat(B41-101N)和Tatqs，進(jìn)一步支持N端序列對Tat誘導(dǎo)C末端抗體具有抑制作用的推測；(6)缺失Cys-rich區(qū)的Tatqs與天然Tat相比顯著提高了蛋白的穩(wěn)定性(形成的二聚體明顯降低，結(jié)果未示)，但無論是Tatqs(缺失Cys-rich區(qū))，還是TatCC和TatCN(改變Cys-rich的位置)誘導(dǎo)的抗血清均低于天然Tat，提示Cys-rich的

14、自佐劑作用必須依賴于天然Tat構(gòu)象。 四、不同Tat抗原檢測HIV-1型感染者血清抗Tat抗體的比較 用原核表達(dá)的天然Tat、7個改造后的Tat(Tat(B41-101N)、Tat(B41-101C)、Tat(B41-61N)、Tat(B41-61C)、TatCC、TatCN、Tatqs)和5個肽段(Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)、Tat(38-101aa)、Tat(49-101aa)、Tat(60-1

15、01aa))檢測與HIV-1型感染者血清(12例天然Tat檢測為抗Tat抗體陽性和10例抗Tat抗體陰性)的結(jié)合反應(yīng)。 ELISA結(jié)果顯示：(1)HIV病人顯示出不同Tat抗原反應(yīng)模式：①與Tat(41-61C)為代表的多種抗原反應(yīng)的血清比例最高，OD值最高；②以Tat(22-72aa)抗原反應(yīng)為主的血清比例次高，OD值最低，大部分單獨陽性，個別TatCN抗原也有反應(yīng)；③以TatCN抗原反應(yīng)為主的血清較少，OD值較高，多與其他

16、抗原也有陽性反應(yīng)。提示不同的病人血清對天然Tat產(chǎn)生出性質(zhì)不同的抗體，這些不同的抗體反映模式與HIV感染進(jìn)程、病情進(jìn)展及預(yù)后是否存在某種相關(guān)性，以及對Tat免疫原的改造有何提示，值得進(jìn)一步研究；(2)不同的抗原檢測的OD值和陽性率存在較大的差別，其中多種抗原的檢測效果明顯優(yōu)于天然Tat，這些抗原是否具有互補性，值得進(jìn)一步研究，以提高Tat抗體的檢測效果；(3)分別比較Tat(B41-101C)和Tat(B41-101N)，Tat(B41

17、-61C)和Tat(B41-61N)兩組抗原與病人血清的反應(yīng)性，結(jié)果顯示缺失N端序列的Tat(B41-101C)和Fat(B41-61C)分別高于Tat(B41-101N)和Tat(B41-61N)，提示N端序列對C端抗原與病人血清的反應(yīng)可能具有抑制效應(yīng)。 總結(jié)： 1．本課題成功將Tat分成五個區(qū)段原核表達(dá)，五個肽段能正確地反映天然Tat所誘導(dǎo)抗體的分布狀況，可用于本研究的抗體表位譜分析。 2．我們成功構(gòu)建并表達(dá)

18、出7種Tat新型免疫原。新的免疫原顯示出了與天然Tat不同的免疫原性，誘導(dǎo)出高滴度的與天然Tat性質(zhì)不同的抗體，為開發(fā)出更為有效的新型Tat疫苗奠定基礎(chǔ)，同時對Tat分子的結(jié)構(gòu)與功能的深入了解具有重要意義。 3．本課題用Tat五個肽段和多種改造后Tat蛋白檢測HIV病人血清抗Tat抗體發(fā)現(xiàn)HIV病人可對Tat產(chǎn)生不同的抗體譜，對進(jìn)一步深入分析Tat抗體模式與疾病發(fā)展的相關(guān)性和有效Tat疫苗的研發(fā)意義重大，同時也為研發(fā)出高特異性、