HIV-1 MA蛋白的表達純化及免疫原性的初步研究.pdf

1、HIV-1基質蛋白在病毒的組裝、出芽等方面起重要的作用。而且比較保守，變異發(fā)生率低，而且是細胞免疫應答的靶抗原，能夠產生較好的免疫效果。
　　 本研究以保藏菌株質粒pNL4-3為模板，在引物設計時加入TAA終止密碼子，通過聚合酶鏈式反應擴增獲得艾滋病病毒MA蛋白編碼序列，含有399 bp，編碼132個氨基酸殘基，蛋白質分子量大約為17 kD，等電點為9.27。把帶有相應酶切位點的MA編碼序列克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a(

2、+)中，構建了重組表達載體pET028a-ma，經PCR鑒定、雙酶切鑒定以及測序分析證實重組質粒正確。將該重組質粒轉化E.coli BL21(DE3)，37℃時經IPTG誘導后，將菌體裂解，作聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，與陰性對照實驗相比在20 kD附近有一條特異性蛋白質條帶，MA蛋白17 kD融合載體His標簽3.56 kD，說明目的蛋白MA成功表達，大小與預測結果相符。
　　 表達的融合蛋白是可溶的，菌體裂解后存在于上清中。利用

3、金屬鎳親和層析的方法初純化蛋白。再經過凝膠過濾層析，離子交換層析純化后可以獲得較純的蛋白質，經過MALDI-TOF MS鑒定其為帶有His標簽的MA蛋白。將純化后的融合蛋白與免疫佐劑混合后，分四次免疫新西蘭雄兔，獲得特異性較強的多克隆抗體，并利用原核表達的融合蛋白制備抗原親和層析柱對抗體進行純化。獲得純度及特異性較好的抗體，用于目的蛋白MA真核表達的鑒定純化。
　　 在真核方面，把帶有相應酶切位點的MA編碼序列克隆到供體質粒pF

4、astBac1中，并且鑒定重組成功；用供體質粒pFastBac1-ma轉化DH10Bac，通過藍白斑篩選獲得重組的Bacmid-ma，利用PCR的方法和測序鑒定，說明重組成功。提取重組的Bacmid-ma基因組，用其轉染家蠶卵巢上皮細胞，待細胞發(fā)病后；經過PCR鑒定，獲得重組有MA編碼序列的桿狀病毒。發(fā)病細胞經過傳代后，用自制的兔多克隆抗體為一抗，Western blotting鑒定目的蛋白MA在桿狀病毒表達系統中成功表達，并且不帶有任