β-淀粉樣多肽人源性單鏈抗體的制備與功能鑒定.pdf

1、阿爾茨海默病(AD)患者腦內(nèi)β-淀粉樣多肽(Aβ)的形成和積聚，具有直接和間接的神經(jīng)毒性作用，在AD發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。阻止AD患者腦內(nèi)Aβ積聚并予以清除已成為抗AD病因?qū)W療法的重要靶點(diǎn)。靶向Aβ的免疫治療，特異性高，副作用小?？笰β抗體通過多種機(jī)制介導(dǎo)腦內(nèi)Aβ的清除，減輕轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)的Aβ負(fù)荷，緩解認(rèn)知障礙。然而單克隆抗體的鼠源性特征限制其在臨床使用。本研究試圖從全人源性噬菌體抗體庫中篩選出抗Aβ特異性單鏈抗體，在充分鑒定

2、其生物學(xué)活性及其可能的抗Aβ藥理學(xué)作用后，建立新的AD免疫療法。 研究中，首先以Aβ1-40為靶標(biāo)，應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)，結(jié)果經(jīng)過五輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”親和篩選，隨機(jī)挑取單克隆噬菌體抗體進(jìn)行噬菌體ELISA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株高特異性抗Aβ噬菌體抗體——E3克隆。進(jìn)一步提取E3克隆噬菌粒，轉(zhuǎn)化HB2151誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生抗Aβ可溶性E3單鏈抗體，并進(jìn)行His-trap親和層析純化。Westernblot證實(shí)E3單鏈抗體可與人工合成

3、的Aβ特異性結(jié)合，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，E3單鏈抗體還可與大腦皮層神經(jīng)元天然分泌的Aβ特異性結(jié)合。將E3單鏈抗體與Aβ單體或Aβ纖維在體外共同孵育，透射電子顯微鏡和硫黃素T熒光分析顯示，E3單鏈抗體在體外不僅可阻止Aβ的聚集，更可逆轉(zhuǎn)Aβ的纖維聚集。在SK-N-SH細(xì)胞模型上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，20μMAβ聚集物處理組的細(xì)胞MTT值減少約60﹪；而用抗Aβ可溶性E3單鏈抗體處理后，細(xì)胞MTT值則增高，增高的程度與加入的E3抗體濃度呈正比，