單鏈抗體e23sFv的人源化抗體制備及其在HER2靶向腫瘤殺傷中的功能鑒定.pdf

1、HER2（p185erbB2/neu）是EGFR家族的成員，在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，是腫瘤惡性行為以及不良預(yù)后的標(biāo)志。靶向治療是 HER2陽(yáng)性腫瘤的重要治療手段，主要包括靶向 HER2的單克隆抗體、單鏈抗體偶聯(lián)效應(yīng)分子等策略。HE R2治療性單克隆抗體能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、延長(zhǎng)生存期，是HE R2陽(yáng)性進(jìn)展期乳腺癌及胃癌的一線療法。這些H ER2靶向的治療性抗體都由鼠源單克隆抗體經(jīng)人源化改造而來(lái)，長(zhǎng)期應(yīng)用未

2、觀察到嚴(yán)重的免疫原性相關(guān)副作用。HE R2單鏈抗體來(lái)源于單克隆抗體，常與生物效應(yīng)分子融合表達(dá)或者表達(dá)于T細(xì)胞表面（CAR-T）靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)鼠源單鏈抗體的人源化改造，是以其為基礎(chǔ)的腫瘤靶向殺傷策略走向臨床的重要一環(huán)。本研究以本組前期系列驗(yàn)證的、靶向效果明確的鼠源單鏈抗體e23sFv為模板，擬解決兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：一是在探索單鏈抗體人源化的技術(shù)改進(jìn)；二是評(píng)價(jià)該人源化單鏈抗體用于腫瘤靶向治療的有效性。
　　針對(duì)第

3、一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，本研究進(jìn)行了兩方面新的摸索。首先，在傳統(tǒng)的鼠源互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）—人源框架區(qū)（FR）移植策略的基礎(chǔ)上，拓寬了人源化改造 FR模板的選擇范圍，既選了與e23sF v同源性最高的全人抗體特異序列，也選了與e23sF v同源性最高的全人抗體亞類的通用序列，并將二者對(duì)比，為抗體人源化的FR模板選擇提供線索。其次，針對(duì)所選的人源抗體亞類通用序列，將FR關(guān)鍵殘基突變回鼠源親本，以維持抗原構(gòu)象、避免喪失親和力。傳統(tǒng)的突變策略有兩種：一

4、是定點(diǎn)突變，前提是抗體結(jié)構(gòu)信息必須明確；二是隨機(jī)突變，雖然可提高親和力的多樣性，但篩選工作量大。嘗試將這二者相結(jié)合，選擇13個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，同時(shí)又通過(guò)設(shè)計(jì)同位點(diǎn)的不突變對(duì)照、引物的隨機(jī)組合分組等方法，增加這13個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)突變與組合的幾率，最終結(jié)合噬菌體抗體展示技術(shù)，建立了庫(kù)容為213的突變抗體庫(kù)，經(jīng)4輪親和力淘選和噬菌體ELIS A篩選，獲得4株高親和力的人源化單鏈抗體。
　　基于上述構(gòu)建和篩選，本研究得到2

5、株特異序列來(lái)源的人源化單鏈抗體SGF1、SGF2，4株通用序列來(lái)源的人源化單鏈抗體P1 h2、P1 h3、P2 h2、P2 h5。通過(guò)同源建模的方法，模擬了e23sFv、SGF1、P1h2的結(jié)構(gòu)并與HER2分子進(jìn)行對(duì)接，預(yù)測(cè)人源化單鏈抗體的識(shí)別表位位于HER2胞外段第IV結(jié)構(gòu)域，且SGF1主鏈碳原子構(gòu)象比P1h2更接近e23sFv，而P1h2與HER2相互作用能比SGF1更強(qiáng)。經(jīng)過(guò)原核蛋白表達(dá)純化、包涵體復(fù)性，獲得蛋白純度大于90％，進(jìn)

6、行功能評(píng)價(jià)：①親和力：通過(guò)表面等離子共振實(shí)驗(yàn)（SPR）觀察人源化單鏈抗體對(duì)人重組 HER2的親和力，結(jié)果顯示P1h2、P1 h3、SGF1比e23sF v提高約10倍，P2 h2、P2 h5則與e23 sFv相當(dāng)；細(xì)胞ELISA觀察它們對(duì)細(xì)胞表面天然表達(dá)HER2的親和力，結(jié)果與SPR實(shí)驗(yàn)一致。②識(shí)別表位：熒光素標(biāo)記人源化單鏈抗體，競(jìng)爭(zhēng)性流式細(xì)胞術(shù)觀察到，人源化單鏈抗體的 HER2識(shí)別表位與e23sFv相同。③內(nèi)化活性：激光共聚焦顯微鏡觀

7、察結(jié)果表明，熒光素標(biāo)記的人源化單鏈抗體 P1h2、P1h3、SGF1能夠特異性結(jié)合并內(nèi)化進(jìn)入 HER2陽(yáng)性細(xì)胞；P2h2、P2h5、SGF2則不能內(nèi)化。④免疫原性：ELISPOT及抗體偶聯(lián)磁珠技術(shù)檢測(cè)人源化單鏈抗體刺激細(xì)胞因子分泌的水平，結(jié)果表明，人源化單鏈抗體刺激PBMCs產(chǎn)生 IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子的水平較鼠源單鏈抗體大幅下降，減少到鼠源單鏈抗體刺激水平的1/20。值得注意的是，特異序列來(lái)源的SGF1比通用序列來(lái)源的4株人源

8、化單鏈抗體刺激細(xì)胞因子分泌的水平更高，提示其免疫原性相對(duì)較強(qiáng)。綜上，從6株不同序列來(lái)源的人源化單鏈抗體中，優(yōu)選出兩株免疫原性低、親和力高并且具有內(nèi)化活性的單鏈抗體P1h2和P1h3，進(jìn)行后續(xù)功能研究。
　　針對(duì)第二個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，探索了P1h2和P1 h3用于兩種靶向治療策略的有效性：一是基于補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC）的間接腫瘤殺傷；二是基于本組前期建立成熟的免疫促凋亡策略的直接腫瘤殺傷。①C DC策略：在人源化單鏈抗體的C端融合

9、表達(dá)人 IgG1Fc，構(gòu)建獲得系列 scF v-Fc融合蛋白，進(jìn)行真核系統(tǒng)表達(dá)純化。流式細(xì)胞術(shù)和體外CDC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P1h2-Fc、P1h3-Fc融合蛋白均能與HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，間接殺傷腫瘤細(xì)胞。HER2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞及中度表達(dá)的肺癌細(xì)胞中，P1h2-Fc、P1h3-Fc的殺傷作用均強(qiáng)于e23sFv-Fc。②免疫促凋亡策略：將人源化單鏈抗體構(gòu)建替換入課題組前期建立的免疫促凋亡分子，獲得scFv-Fdt-tBid，進(jìn)

10、行原核系統(tǒng)可溶表達(dá)純化。流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)觀察到， P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid能夠特異性結(jié)合HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，有效抑制細(xì)胞增殖；在 HE R2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、中度表達(dá)的肺癌細(xì)胞中，二者對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制與e23sFv-Fdt-tBid相當(dāng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分別采用NOD-SCID鼠的三種不同荷瘤模型（乳腺癌原位瘤、胃癌原位瘤、肺癌皮下移植瘤），明確觀察到人源化改構(gòu)免疫促凋亡分子的體內(nèi)抗腫瘤活

11、性。在乳腺癌和胃癌模型中，P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid的腫瘤抑制作用強(qiáng)于 e23sF v-Fdt-tBid；而肺癌模型中，二者的抗腫瘤作用與e23sFv-Fdt-tBid相當(dāng)。
　　綜上所述，本研究通過(guò)優(yōu)化CDR移植策略，針對(duì)抗HER2鼠源單鏈抗體e23sF v進(jìn)行人源化改構(gòu)，成功篩選獲得免疫原性降低、親和力提高并具有內(nèi)化活性的兩株人源化單鏈抗體 P1h2、P1 h3，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其用于 CDC策