靶向HER2抗體穩(wěn)定性改造及功能優(yōu)化研究.pdf

1、抗體藥物是當(dāng)前藥物研發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域。作為一種重組蛋白，抗體藥物在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存以及體內(nèi)使用過程中，容易發(fā)生多種降解;其中脫酰胺和異構(gòu)化作用是兩種最常見的化學(xué)降解方式，影響抗體穩(wěn)定性、生物學(xué)活性及生物利用度。提高抗體藥物穩(wěn)定性對抗體成藥性至關(guān)重要。
　　除提高穩(wěn)定性外，優(yōu)化抗體效應(yīng)功能也是增強(qiáng)抗體臨床療效的一個重要研究方向。治療性抗體雖然具有很強(qiáng)的靶向性，但是單獨(dú)用藥的治療效果有限，尤其是對于實(shí)體瘤的治療。細(xì)胞毒性藥物雖然對癌細(xì)胞具

2、備很強(qiáng)的殺傷效力，但是缺乏靶向性，常常誤傷正常細(xì)胞，從而引起嚴(yán)重的毒副作用?？贵w-小分子藥物偶聯(lián)物(ADC)利用抗體作為載體將細(xì)胞毒性藥物送至靶部位，并通過細(xì)胞內(nèi)吞效應(yīng)進(jìn)入溶酶體，釋放出細(xì)胞毒性藥物，從而達(dá)到專一性殺死癌細(xì)胞而不損傷正常組織細(xì)胞的作用。將抗體高特異性和細(xì)胞毒性藥物高毒性有機(jī)結(jié)合的ADC藥物成為提高抗體效應(yīng)功能的一個重要發(fā)展方向。
　　Genentech公司的單抗藥物Herceptin是美國FDA批準(zhǔn)上市的第一個乳腺

3、癌靶向治療的抗體藥物，2014年全球銷售額達(dá)68億美元。該藥物由于穩(wěn)定性等因素選擇了凍干制劑。研究顯示，Herceptin抗體可變區(qū)潛在的脫酰胺效應(yīng)、異構(gòu)化效應(yīng)是影響其穩(wěn)定性的主要因素之一。
　　研究目的:
　　本研究的目的是在保持抗體Herceptin生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上提高其穩(wěn)定性，優(yōu)化、篩選新的靶向HER2候選抗體;在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建抗體-小分子藥物偶聯(lián)物，比較不同抗體、小分子藥物以及偶聯(lián)方式對ADC活性的影響，為進(jìn)

4、一步的ADC藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法
　　借助計(jì)算機(jī)分子模擬及合理設(shè)計(jì)技術(shù)分析、確定Herceptin抗體可變區(qū)脫酰胺和異構(gòu)化熱點(diǎn)及優(yōu)化突變策略;利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)突變Herceptin(T-mAb1)抗體可變區(qū)兩個脫酰胺和異構(gòu)化的降解熱點(diǎn)LC-CDR1-Asn30、HC-CDR3-Asp102;通過真核表達(dá)、親和純化獲得突變體T-mAb2;經(jīng)質(zhì)譜、肽圖對突變位點(diǎn)進(jìn)行鑒定后，利用液相、CE-SDS、icIEF等對T

5、-mAb2的理化性質(zhì)進(jìn)行全面分析，通過SEC、IEC、肽圖質(zhì)譜等方法比對研究T-mAb2與母本抗體T-mAb1在不同pH條件下的長期、加速及高溫穩(wěn)定性;利用FACS、ELISA、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)對抗體T-mAb2的生物學(xué)活性進(jìn)行評價。進(jìn)一步通過體外結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)對T-mAb1、T-mAb2以及T-mAb3（我室從頭設(shè)計(jì)制備的一株與T-mAb1作用表位相同的抗體）與毒素分子DM1、MMAE偶聯(lián)形成的ADC進(jìn)行生物學(xué)活

6、性對比研究。
　　研究結(jié)果:
　　1、通過距離幾何學(xué)、計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)，借助搭建的抗體T-mAb1與抗原HER2胞外區(qū)作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)，合理判定了二者相互識別的關(guān)鍵區(qū)域;利用計(jì)算機(jī)輔助分子模擬、對接技術(shù)對于抗體T-mAb1輕鏈可變區(qū)潛在脫酰胺位點(diǎn)(LC-CDR1-Asn30)和重鏈可變區(qū)潛在的異構(gòu)化熱點(diǎn)(HC-CDR3-Asp102)進(jìn)行合理優(yōu)化突變，搭建新抗體T-mAb2空間結(jié)構(gòu)及其與HER2胞外區(qū)相互作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)。T-m

7、Ab1和T-mAb2與HER2相互作用模式理論預(yù)測結(jié)果表明:與T-mAb1相比，T-mAb2的穩(wěn)定性提高，但與HER2的結(jié)合活性有所下降。
　　2、質(zhì)譜、肽圖等研究結(jié)果顯示，在T-mAb2抗體中，降解熱點(diǎn)LC-CDR1-Asn30、HC-CDR3-Asp102被成功突變?yōu)長C-CDR1-Gln30和HC-CDR3-Glu102;抗體理化性質(zhì)分析顯示，T-mAb2與T-mAb1具有相似的多聚體水平、相同的等電點(diǎn)，但是T-mAb2的電

8、荷變異體水平要明顯低于T-mAb1。
　　3、FACS、ELISA等體外結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T-mAb2能夠特異地識別HER2抗原，但其結(jié)合活性要弱于T-mAb1（約3倍）;Biacore親和力分析結(jié)果與理論預(yù)測結(jié)果一致，抗體T-mAb2親和力弱于母本抗體T-mAb1(4.7nM vs1.0nM)，兩者結(jié)合HER2抗原的結(jié)合速度相近，但是解離速度比T-mAb1快大約5倍。T-mAb2在體外細(xì)胞模型中能有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，但其

9、抑制活性略弱于T-mAb1;在體內(nèi)移植瘤動物模型實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水對照組相比，Herceptin(@)、T-mAb1以及T-mAb2均有明顯的抑瘤活性，且三者的抑瘤活性沒有明顯差異。
　　4、在長期穩(wěn)定性(4℃)和加速穩(wěn)定性(25℃)研究中，pH5.1、6.0和6.3條件下，T-mAb1和T-mAb2的穩(wěn)定性基本一致。在40℃高溫、不同pH條件下，T-mAb1和T-mAb2的多聚體水平也無明顯差異，但是二者的電荷變異體有顯著的差異

10、。pH6.0和6.3條件下，抗體T-mAb1可以檢測到明顯的由LC-CDR1-Asn30脫酰胺引起的酸性變異體(AP2)，且隨著pH的增加AP2的含量也明顯增加;而T-mAb2抗體則沒有檢測到酸性變異體(AP2)。T-mAb1和T-mAb2中均只有在pH5.1條件下可檢測到酸性變異體AP1（由抗體Fc段VSNK序列中的N，在酸性條件下脫酰胺產(chǎn)生），且兩者之間無明顯差異。在T-mAb1中，可以檢測到明顯的由HC-CDR3-Asp102異構(gòu)

11、化產(chǎn)生的堿性變異體(BP1)，且隨著pH的降低BP1的含量逐漸增加;而在T-mAb2中未檢測到明顯的BP1變異體。并且，與T-mAb1相比，T-mAb2在抗體可變區(qū)進(jìn)行的氨基酸突變沒有引入新的翻譯后修飾。
　　5、在乳腺癌細(xì)胞系SKBR3中，母本抗體T-mAb1偶聯(lián)毒素分子DM1后結(jié)合活性無明顯變化，但偶聯(lián)毒素分子MMAE后結(jié)合活性略有下降;抗體T-mAb2和T-mAb3偶聯(lián)毒素分子DM1和MMAE后，結(jié)合活性無明顯變化。而在胃癌

12、細(xì)胞系N87中，T-mAb1、T-mAb2和T-mAb3分別與兩種毒素分子偶聯(lián)后，結(jié)合活性均有下降，其中T-mAb1下降最為明顯。
　　T-mAb1-DM1、T-mAb2-DM1和T-mAb3-DM1三種ADC可明顯殺傷腫瘤細(xì)胞SKOV3和SKBR3，其殺傷活性無明顯差異;且均要明顯高于對胃癌細(xì)胞N87的殺傷;T-mAb1-MMAE、T-mAb2-MMAE和T-mAb3-MMAE三種ADC對SKOV3和SKBR3均有明顯的殺傷作用

13、，且殺傷活性無明顯區(qū)別;而三種ADC抗體對胃癌細(xì)胞的殺傷活性要明顯高于SKOV3和SKBR3。
　　在SKOV3和SKBR3中，同一抗體偶聯(lián)不同毒素對細(xì)胞的殺傷無明顯差異;但在胃癌細(xì)胞N87中，抗體T-mAb1、T-mAb2、T-mAb3偶聯(lián)MMAE形成的ADC的殺傷活性要明顯高于其偶聯(lián)DM1形成的ADC，分別高約12倍、42倍和28倍。
　　結(jié)論:
　　1、Herceptin的脫酰胺和異構(gòu)化的兩個降解熱點(diǎn)突變后，其穩(wěn)

14、定性明顯得到了提高，雖然其體外結(jié)合活性略有下降，但是不影響其體內(nèi)的抑瘤活性。
　　2、抗體與DM1、MMAE等小分子偶聯(lián)形成的ADC細(xì)胞毒作用具有一定的細(xì)胞選擇性。三種抗體與DM1偶聯(lián)的ADC對SKOV3、SKBR3細(xì)胞的殺傷作用要強(qiáng)于N87細(xì)胞;而與MMAE偶聯(lián)的ADC對N87細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)于對SKOV3及SKBR3細(xì)胞。并且，在胃癌細(xì)胞N87中，抗體偶聯(lián)MMAE形成的ADC的殺傷活性要明顯高于其偶聯(lián)DM1形成的ADC。