家蠶BmHh抗體制備及其在中腸中的功能初探.pdf

1、Hedgehog信號(hào)通路作為從果蠅到哺乳動(dòng)物進(jìn)化上高度保守且與發(fā)育相關(guān)的通路之一，在成體組織穩(wěn)態(tài)維持和組織修復(fù)方面發(fā)揮著必不可少的作用，而它的異常變化與人類多種腫瘤疾病相關(guān)。自從果蠅中發(fā)現(xiàn)Hedgehog基因后，脊椎動(dòng)物中的Hh同源基因也相繼被發(fā)現(xiàn)。Hh在進(jìn)化上高度保守，主要由HhC和HhN兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中，HhC結(jié)構(gòu)域催化Hh蛋白前體裂解并激活Hh蛋白活性，而HhN行使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。Hh分泌蛋白配體家族作為多細(xì)胞生物中細(xì)胞命運(yùn)選

2、擇的主要調(diào)控者，在胚胎發(fā)育和胚胎后組織穩(wěn)態(tài)的器官形成中發(fā)揮著重要的作用。廣泛分布的Hh蛋白是通過(guò)劑量依賴的方式進(jìn)入細(xì)胞使其產(chǎn)生不同的細(xì)胞命運(yùn)?，F(xiàn)在研究表明，HH信號(hào)通路通過(guò)參與腸道干細(xì)胞增殖來(lái)維持腸道穩(wěn)態(tài)和組織再生，然而，家蠶中腸中關(guān)于該基因的功能還鮮有報(bào)道。
　　家蠶作為鱗翅目昆蟲的重要代表，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。腸道作為家蠶第二大器官，在其完全變態(tài)發(fā)育過(guò)程中也不斷進(jìn)行著組織重構(gòu)、退化和再生。為了了解Hedgehog配體蛋白在家蠶

3、中腸穩(wěn)態(tài)維持和組織修復(fù)中可能的調(diào)控作用，本研究基于生物信息學(xué)研究方法，鑒定克隆了家蠶BmHh基因并對(duì)其基因序列信息進(jìn)行分析，進(jìn)一步對(duì)其在家蠶中腸中功能進(jìn)行了初步探索，獲得以下研究成果：
　　1、家蠶BmHh基因序列信息分析
　　以 NCBI和家蠶基因組等數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定得到了家蠶BmHh基因，采用PCR和RACE等技術(shù)獲得了家蠶BmHh基因全長(zhǎng)序列，進(jìn)一步分析顯示，該基因定位于9號(hào)染色體，含有5個(gè)外顯子和

4、4個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)為3172bp，CDS為1149bp，編碼383aa，預(yù)測(cè)蛋白分子量42.37kDa，具有兩個(gè)典型的HhN和HhC蛋白結(jié)構(gòu)域。通過(guò)各物種間Hh基因多重序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該基因在進(jìn)化上比較保守。
　　2、家蠶BmHh表達(dá)特征分析及其亞細(xì)胞定位
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì) BmHh的表達(dá)特征進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，BmHh在家蠶五齡三天各組織中均有表達(dá)，推測(cè) HH通路廣泛存在家蠶各組織中;進(jìn)一步檢

5、測(cè) BmHh在家蠶幼蟲中腸不同時(shí)期中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因在家蠶幼蟲各時(shí)期的蛻皮前期表達(dá)量較高，推測(cè)在蛻皮前期腸道開始進(jìn)行組織重構(gòu)，細(xì)胞分裂活動(dòng)較旺盛，BmHh可能參與家蠶中腸腸道干細(xì)胞的增殖及分化形成成熟腸細(xì)胞。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)家蠶 BmHh蛋白具有信號(hào)肽，是一種分泌蛋白。進(jìn)一步構(gòu)建該基因過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn) BmHh蛋白主要分布在細(xì)胞核附近的細(xì)胞質(zhì)中，推測(cè)家蠶BmHh蛋白也存在相似的蛋白加工修飾過(guò)程。
　

6、　3、家蠶BmHh蛋白抗體制備及特異性檢測(cè)
　　基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，從 BmHh編碼框中選取一個(gè)756bp的特異性片段，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增后連接到PET-32a（+）上成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒。采用最適溫度和IPTG濃度誘導(dǎo)獲得重組蛋白，進(jìn)一步蛋白純化后注射小鼠獲得免疫血清，ELISA檢測(cè)效價(jià)為1:16000，即成功獲得了BmHh蛋白多克隆抗體。收集家蠶卵巢細(xì)胞系分別通過(guò)Western blot和免疫熒光對(duì)

7、抗體特異性檢測(cè)，結(jié)果表明制備的BmHh蛋白多克隆抗體有效，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。
　　4、家蠶BmHh在家蠶卵巢細(xì)胞系和中腸中的功能初探
　　家蠶卵巢細(xì)胞系中分別添加BmHh的RNA干涉雙鏈和HH通路抑制劑環(huán)靶明后，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HH通路主要基因Hh、Ptc、Smo和Ci基因表達(dá)均下調(diào)，BrdU免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖水平均顯著降低。同樣的，家蠶注射抑制劑環(huán)耙明后中腸中也得到相同的結(jié)果，推測(cè) BmHh及 HH信號(hào)通路參與