家蠶GATA轉(zhuǎn)錄因子BmGATA6的抗體制備及其在中腸中的功能分析.pdf

1、家蠶作為一種良好的鱗翅目模式生物，在其變態(tài)發(fā)育中發(fā)生著大量的細(xì)胞凋亡過程，是作為細(xì)胞凋亡研究的一個(gè)理想材料。此外在哺乳動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，GATA6上調(diào)會(huì)促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡。而在斑馬魚中的研究發(fā)現(xiàn)，GATA6基因的表達(dá)水平下調(diào)會(huì)引起腸道平滑肌的功能缺陷，還會(huì)引起腸道的異常發(fā)育。家蠶是完全變態(tài)昆蟲，一生要經(jīng)歷多次蛻皮期，每次蛻皮過程中中腸組織都要經(jīng)歷一次重塑，即伴隨著大量舊細(xì)胞的自噬和凋亡，新細(xì)胞也在不斷產(chǎn)生，此過程中，需要

2、各分子網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控。
　　GATA是基因啟動(dòng)子中的一段保守核酸序列，目前發(fā)現(xiàn)了許多可識(shí)別GATA序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，都具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的功能，因此這些蛋白統(tǒng)稱為GATA轉(zhuǎn)錄因子。家蠶中已報(bào)道的GATA轉(zhuǎn)錄因子有BmGATAα、BmGATAβ與BmGATA6。關(guān)于BmGATAα的功能暫無報(bào)道。Drevet等報(bào)道了BmGATAβ，通過選擇性剪切，形成3種剪切體：BmGATAβ1特異地在家蠶性腺中表達(dá)；BmGATAβ2在幼蟲與蛹的多種

3、組織中表達(dá)；而BmGATAβ3只在蛹期卵泡中表達(dá)。且BmGATAβ1與卵泡細(xì)胞的形成和絨毛膜基因的表達(dá)有關(guān)，而有關(guān)另外2種剪切形式的功能尚未見報(bào)道。關(guān)于BmGATA6，只在NCBI中收錄了序列信息，因此我們對(duì)BmGATA6的功能進(jìn)行了初步的研究。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.BmGATA6全長克隆及分析
　　家蠶GATA轉(zhuǎn)錄因子BmGATA6的cDNA全長4011bp，ORF長為1974 bp，編碼657個(gè)氨基酸，包括20

4、5 bp的5′非翻譯區(qū)序列（5′UTR）和1832 bp的3′非翻譯區(qū)序列（3′UTR）。該基因位于15號(hào)染色體上，基因全長12326 bp，為多外顯子基因，共含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，具有2個(gè)典型的GATA鋅指結(jié)構(gòu)域，分別位于第470—521和531—582氨基酸區(qū)域。與其它物種中的BmGATA6同源序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示BmGATA6較為保守，且與帝王斑蝶的GATAc聚為一類，與其為同源蛋白。
　　2.BmG

5、ATA6表達(dá)分析
　　RT-PCR結(jié)果顯示BmGATA6在5齡第3天家蠶中腸中顯著高量表達(dá)，其次在馬氏管中有少量表達(dá)，而在其他組織中沒有檢測(cè)到BmGATA6的表達(dá)。同時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示BmGATA6在4齡眠期到熟蠶期的中腸組織中持續(xù)高表達(dá)。
　　3.BmGATA6多克隆抗體的制備
　　選取BmGATA6編碼框中N端944bp的特異片段，構(gòu)建BmGATA6原核表達(dá)載體，通過不同溫度與 IPTG濃度誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，BmGAT

6、A6重組蛋白在16℃誘導(dǎo)主要存在于上清中，在37℃誘導(dǎo)主要存在于包涵體中。在0.6 mmol?L-1的IPTG、16℃下誘導(dǎo)20 h為最佳條件，利用鎳柱親和層析法獲得較純的BmGATA6重組蛋白，并利用純蛋白多次免疫昆明小鼠制備多克隆抗體，用ELISA法對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè)，顯示BmGATA6抗體效價(jià)均高達(dá)1﹕128000。Western blot結(jié)果顯示BmGATA6抗體能特異的識(shí)別家蠶BmGATA6蛋白，其大小約為75 kD，與預(yù)測(cè)

7、大小相符。免疫熒光結(jié)果顯示BmGATA6蛋白在家蠶中腸的各類細(xì)胞中均有較高表達(dá)，且定位于中腸細(xì)胞的細(xì)胞核中。
　　4.BmGATA6在中腸中的功能研究
　　BmGATA6蛋白的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，BmGATA6在中腸中高表達(dá)，其它組織表達(dá)較低，而在中腸的發(fā)育各時(shí)期中預(yù)蛹期時(shí)的表達(dá)量最高。我們利用dsRNA干涉家蠶熟蠶期的BmGATA6基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干涉24h后，中腸BmGATA6的表出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，且BmGATA6的中腸免