1、摘要在生物和非生物逆境下，植物體都會(huì)產(chǎn)生大量活性氧。一方面，活性氧作為二級(jí)信使是植物逆境信號(hào)傳導(dǎo)所必需的另一方面，過(guò)量的活性氧又會(huì)對(duì)植物體造成不可逆損傷。因此，逆境下植物必須嚴(yán)格控制其體內(nèi)的活性氧含量，使活性氧的產(chǎn)生和分解處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持正常細(xì)胞功能。植物抗氧化系統(tǒng)負(fù)責(zé)清除體內(nèi)過(guò)量活性氧。揭示植物體抗氧化基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制不僅有助于我們對(duì)活性氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑的理解，而且對(duì)于改良作物的抗逆性有重要意義。廣泛存在于植物中的負(fù)責(zé)清除過(guò)氧化氫
2、的過(guò)氧化氫酶(CAT)，在解除植物的氧化逆境上有重要作用。其中以玉米CAT系統(tǒng)研究得最徹底。玉米〔atl基因啟動(dòng)區(qū)的一段19bp的DNA序列(ABRE2)是Catl基因響應(yīng)ABA調(diào)控所必須的順式元件(GuanandZhaoeta1.2000)。該元件也介導(dǎo)不依賴于ABA的逆境信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控Catl基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室利用酵母單雜交技術(shù)，從玉米幼胚的cDNA文庫(kù)中分離得到能和玉米‘a(chǎn)t]基因啟動(dòng)子區(qū)ABRE2順式元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子
3、ABP4。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室王磊博士等前期研究發(fā)現(xiàn)，ABP4基因在酵母細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄激活功能，在玉米中是一類不依賴于ABA的能夠與Cat]基因ABRE2元件相互作用的bZIP類反式因子。那么，ABP4特異識(shí)別ABRE2順式元件中的哪些特定堿基它能否調(diào)控抗逆相關(guān)基因的表達(dá)其表達(dá)對(duì)體內(nèi)ROS含量是否有調(diào)節(jié)作用ABP4在抗生物逆境和非生物逆境反應(yīng)中有什么作用為此，本論文利用體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因手段對(duì)ABP4的功能進(jìn)行了深入分析。本論文研究工作得到以下
4、主要結(jié)果:1.通過(guò)GRA實(shí)驗(yàn)分析了玉米Cat]啟動(dòng)子ABRE順式元件中被ABP4蛋白特異識(shí)別的堿基序列。結(jié)果顯示，ABP4蛋白與ABRE順式元件有特異性的結(jié)合，其結(jié)合的核心序列是CGTGGA。該序列上游第3位的C堿基是對(duì)二者結(jié)合具有重要影響的側(cè)翼位點(diǎn)。2.構(gòu)建了ABP4基因的植物表達(dá)載體pPZP21235SproABP4NOSter，通過(guò)真空滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得ABP4轉(zhuǎn)基因植株共88株，T1代PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為79.5%。3.以T1代
5、PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株為材料，利用自交和抗性篩選標(biāo)記在T3代獲得了ABP4轉(zhuǎn)基因的純系植株。4.以純系轉(zhuǎn)基因植株4r156、4F251.4F3615和野生型植株為材料，對(duì)ABP4基因及一系列非生物逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)進(jìn)行Northern分析。結(jié)果表明ABP4在這幾個(gè)純系中有不同程度的表達(dá)，其中以4F251為最強(qiáng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在正常條件下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株中ABP4不能激活非生物逆境相關(guān)基因corl5aerd14.kin].CSD1.FSD3.
6、GST1的表達(dá)。5.以純系轉(zhuǎn)基因植株4F251和野生型植株為材料，進(jìn)行擬南芥基因芯片分析，結(jié)果顯示ABP4在植物體內(nèi)抑制了許多過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)，同時(shí)激活了許多與抗細(xì)菌類活體營(yíng)養(yǎng)菌相關(guān)基因的表達(dá)。6.通過(guò)非生物逆境抗性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在本研究所設(shè)定的非生物逆境條件下，ABP4轉(zhuǎn)基因植株和野生型的抗逆性沒(méi)有差異。7.利用電子自旋共振光譜解析技術(shù)對(duì)植物體內(nèi)活性氧含量的分析結(jié)果表明，與野生型對(duì)照植株相比，ABP4轉(zhuǎn)基因的植株的ROS含量升高，4F
7、156、4F251.4F3615較之野生型分別提高了34.1%43.3%.74.5%。AbstractUnderbothbioticandabioticstressconditionsplantsproducealargeamountofReactiveOxygenSpecies(ROS).ROSasasecondarymessagerplayanimportantroleinplantresponsestoenvironmentals
8、tresses.HoweverexcessROScauseirreversibleinjuryinplant.ThustomaintainnormalcellularfunctiontheROSlevelinplantunderstressmustbestrictlycontrolledsothatitsproductionanddegradationisinbalance.Theantioxidantdefensesysteminpl
9、antisresponsibleforscavengingtheexcessROS.DissectingthemolecularmechanismunderlyingtheregulationofplantantioxidantgenesnotonlyhelpsusunderstandthesignaltransductionpathwayofROSbutalsocontributestoenhancingcroptoleranceto
10、environmentalstress.Catalase(CAT)inplantisresponsibleforscavengingHs02andplaysavitalroleinreleasingplantfromoxidantstress.MaizeCatlpromotercontainsa19bplongciselement(ABRE2)whichisessentialfortheinductionofCat]byABA(Guan
11、andZhaoetal.2000).ABRE2alsomediatestheinductionofCatlbyABAindependenttransductionpathway.ByusingayeastonehybridsystemtoscreenamaizecDNAlibraryaABRE2interactingproteingenenamelyABP4hasbeencloned.ABP4encodesaproteinbelongi
12、ngtobZIPfamilyoftranscriptionfactors.PreviousdatashowedthatABP4activatedABRE2mediatedexpressionofreportergeneinyeastanditsexpressioninmaizeisABAindependent(Wangetal.unpublisheddata).Whichbase(s)inABRE2ciselementcanbespec
13、ificallyrecognizedbyABP4CanABP4inducetheexpressionofstressrelatedgenesDoesABP4regulatetheROSlevelinplantHowdoesABP4expressionregulateplantresponsestoenvironmentalstressesThepresentresearchemploysgelretardationassayandatr
14、ansgenicapproachtofurtheranalyzethefunctionofABP4gene.Theresultsobtainedthroughthepresentresearchareasfollows:1.GelretardationassayresultsrecognizingthesequenceofshowthatABP4proteinbandstoABREbyspecificallyCGTGGA.Themuta
15、tioninthethirdCbase即streamthissequencesubstantiallyafectstheinteraction.2.ArecombinantvectorpPZP21235SproABP4NOSterwasconstructedforABP4expressioninplantandwastransformedintothegenomeofArabidopsisviaagrobacteriummediated
16、transformationbyvacuuminfiltration.88kanamycinresistantTlplantswereobtainedand79.5%ofthemarePCRpositive.3.HomozygousABP4transgeniclineswereobtainedandwereusedasthematerialinthelateranalysis.4.TheexpressionofABP4andsomest