大豆轉(zhuǎn)錄因子GmDREB的功能分析.pdf

1、DREB即干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(dehydrationresponsiveelementbinding)，是參與植物對(duì)干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫應(yīng)答，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)產(chǎn)生各種生理代謝反應(yīng)的關(guān)鍵因子。自1994年Yamaguchi-Shinozaki等首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)DRE核心序列以來，DREB轉(zhuǎn)錄因子基因現(xiàn)已得到廣泛研究和應(yīng)用。目前，在GenBank中注冊(cè)的大豆DREB轉(zhuǎn)錄因子基因不少于15個(gè)。研究表明，這些基因在植物應(yīng)答非生物逆境脅迫

2、途徑中發(fā)揮著重要作用。 本實(shí)驗(yàn)室從大豆的cDNA表達(dá)文庫中克隆了一個(gè)新的抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因——GmDREB(GenBank登錄號(hào)：AF514908)。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，對(duì)其性質(zhì)、功能進(jìn)行了初步探討與研究。 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：該基因具有525bp的cDNA開放閱讀框序列，編碼174個(gè)氨基酸，具有一個(gè)由58個(gè)氨基酸組成的AP2/EREBP保守域，在N末端和C末端分別有一個(gè)核定位信

3、號(hào)區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。 本研究將GmDREB基因的全長編碼序列構(gòu)建到具有CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pCAMBIA1304上，該載體攜帶GFP綠色熒光蛋白基因和GUS報(bào)告基因，均由CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)。借助優(yōu)化的floral-dip法，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，并經(jīng)抗性篩選得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因純合系后代。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代的GUS組織染色分析顯示：在轉(zhuǎn)入pCAMBIA1304的轉(zhuǎn)基因幼苗中，GUS基因通體表達(dá)。而在轉(zhuǎn)入了攜帶目的基

4、因35S:GmDREB-GFP-GUS載體的幼苗中，GUS基因的表達(dá)則表現(xiàn)出組織特異性。在苗齡分別為5d、7d幼苗的主根、側(cè)根、根毛、胚軸及真葉部位，GUS基因大量表達(dá)，而在子葉中不表達(dá)或表達(dá)很弱。GFP熒光定位分析顯示同樣結(jié)果：在pCAMBIA1304的轉(zhuǎn)基因幼苗中，GFP熒光蛋白通體表達(dá)，且定位于整個(gè)細(xì)胞中。而在轉(zhuǎn)35S:GmDREB-GFP-GUS的幼苗中，同GUS報(bào)告基因的表達(dá)相似，GFP綠色熒光主要位于幼苗的根部及胚軸部位，定

5、位于細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞膜，主要集中于細(xì)胞核。 為進(jìn)一步研究GmDREB基因的功能，將轉(zhuǎn)基因植株與野生型對(duì)照經(jīng)干旱和高鹽脅迫處理，然后觀察其表型特征，并分別在0d、6d、15d取樣，測(cè)定其生理指標(biāo)。表型觀察發(fā)現(xiàn)：脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性與耐鹽性較野生型植株明顯提高。生理指標(biāo)測(cè)定表明：干旱和鹽脅迫均會(huì)導(dǎo)致植株含水量下降，但脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株含水量的降低要顯著低于野生型植株含水量的降低；干旱和鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致野生型和轉(zhuǎn)基因型植株