大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子PsBZPl的功能研究.pdf

1、大豆疫霉屬于卵菌門，在親緣關系上與真菌相差甚遠而與褐藻和硅藻比較接近。由于大豆疫霉在生物學特征以及發(fā)病機制等方面與真菌差異較大，所以多數(shù)殺真菌劑對其沒有效果。此外，大豆疫霉基因組不穩(wěn)定，容易發(fā)生基因突變，導致它能夠較快地對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，也能迅速克服寄主植物的抗病性。大豆疫霉等4種疫霉菌全基因組序列的公布和疫霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，為我們從分子水平上了解疫霉菌的致病機理并且尋找廣譜高效的疫霉菌殺菌劑提供了良好的平臺。本研究充分發(fā)揮生物

2、信息學技術(shù)優(yōu)勢，通過對大豆疫霉中一個與致病性相關的MAPK PsSAK1沉默突變體的DGE表達譜分析，篩選到一批可能受PsSAK1調(diào)控的候選基因。選取3個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合PEG介導的大豆疫霉瞬時沉默體系得到沉默突變體后研究大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因功能，為了解大豆疫霉分子致病機理提供了參考。
　　 轉(zhuǎn)錄因子是直接調(diào)控基因表達和應答特定信號途徑的關鍵因子，研究大豆疫霉轉(zhuǎn)錄因子能找到直接調(diào)控大豆疫霉致病性相關的生物學過程的

3、關鍵基因。通過生物信息學分析，我們在大豆疫霉基因組中預測了17個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白長度從168到1042個氨基酸不等。該家族成員序列之間相似性低，并且在基因組上分布分散，只有Ps128339和Ps128400成簇排列于scaffold4。通過在線工具MEME，我們預測了大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族5種可能的功能域，其中motif1存在于所有大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子中且具有bZIP轉(zhuǎn)錄因子連續(xù)亮氨酸間隔排列的特征序列。根據(jù)轉(zhuǎn)錄

4、模式的不同我們將bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族分為5類，大多數(shù)成員在游動孢子、休止孢、休止孢萌發(fā)以及侵染階段上調(diào)表達，根據(jù)上述差異表達基因推測大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子與大豆疫霉游動孢子和休止孢的發(fā)育過程以及致病過程相關。本章生物信息學分析為后續(xù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子功能研究提供了依據(jù)。
　　 PsSAK1是一個與游動孢子活力及致病性相關的MAPK，為找到可能在下游受其調(diào)控的作用元件，在第一章生物信息學分析的基礎上，本章研究挑選了3個在PsSAK

5、1沉默突變體休止孢萌發(fā)階段以及侵染早期均下調(diào)的大豆疫霉bZIP轉(zhuǎn)錄因子進行具體的功能分析，其中PsBZP1全長1622 bp，含有5個內(nèi)含子，編碼的蛋白含413個氨基酸，qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)該基因在大豆疫霉游動孢子、休止孢以及休止孢萌發(fā)階段均上調(diào)表達。通過大豆疫霉瞬時轉(zhuǎn)化體系將其沉默，得到2個沉默效率分別為70％和60％的突變體。通過表型分析發(fā)現(xiàn)，PsBZP1的沉默不影響游動孢子趨化性和菌絲生長速率，但對游動孢子的游動性及活力有嚴重影

6、響。PsBZP1沉默突變體游動孢子不能正常螺旋式前進而原地轉(zhuǎn)圈游動，游動異常比率為39.3％。PsBZP1沉默突變體和野生型在2小時后的平均休止率分別為27.5％和19％，平均萌發(fā)率分別為78％和54％，均顯著提高。PsBZP1沉默突變體休止孢萌發(fā)的芽管畸形，芽管頂端短粗卷曲出現(xiàn)畸形分支，休止孢萌發(fā)的畸形率為72.3％。此外，PsBZP1沉默突變體侵染大豆感病寄主的葉片和黃化苗下胚軸時出現(xiàn)明顯的褐色壞死斑，致病性降低。上述結(jié)果表明，Ps