大豆疫霉RxLR效應(yīng)分子Avh262和Avh172的功能研究.pdf

1、隸屬于卵菌的疫霉屬包含120多個(gè)物種，其中大多數(shù)為破壞性的植物病原菌。作為一個(gè)半活體營養(yǎng)型的病原卵菌，疫霉菌在侵染寄主過程中可以分泌一系列效應(yīng)分子，包括RxLR類效應(yīng)分子來干擾寄主的防御反應(yīng)，從而促進(jìn)病原菌在寄主中的定殖。大豆疫霉的基因組包含400多個(gè)編碼RxLR效應(yīng)分子的基因，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子可以通過精確轉(zhuǎn)錄調(diào)控和團(tuán)隊(duì)協(xié)作來抑制植物的免疫反應(yīng)，但是這些效應(yīng)分子如何通過與寄主植物免疫反應(yīng)的調(diào)控因子相互作用，如何干擾植物的免疫

2、目前所知甚少。本研究首先對(duì)具有抑制植物免疫反應(yīng)能力的38個(gè)效應(yīng)分子的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上對(duì)效應(yīng)分子Avh262和Avh172抑制植物免疫反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，此外還對(duì)大豆-大豆疫霉親和/非親和互作過程中的大豆蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析。主要研究內(nèi)容包括:
　　一、大豆疫霉RxLR效應(yīng)分子的亞細(xì)胞定位分析。本研究對(duì)大豆疫霉RxLR效應(yīng)分子分析，發(fā)現(xiàn)共26個(gè)效應(yīng)分子具有核定位信號(hào)。對(duì)其中8個(gè)具有核定位信號(hào)效應(yīng)分子進(jìn)行定位分析，

3、發(fā)現(xiàn)均主要定位于細(xì)胞核中。本研究發(fā)現(xiàn)具有核定位信號(hào)的效應(yīng)分子Avh52在細(xì)胞核中呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)，核定位信號(hào)對(duì)其特殊定位和促進(jìn)侵染的能力是必需的。本研究對(duì)38個(gè)大豆疫霉毒性所必需和/或能抑制植物免疫的RxLR效應(yīng)分子進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)RxLR效應(yīng)分子定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，效應(yīng)分子Avh172、Avh262以及Avr1d能在病原菌侵染過程中聚集在吸器周圍，這說明了它們可以在吸器周圍發(fā)揮毒性作用來抑制寄主的免疫反應(yīng)。此外，

4、本研究發(fā)現(xiàn)Avh262定位于植物細(xì)胞的微管中，這是首次發(fā)現(xiàn)定位于微管的效應(yīng)分子。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Avh262能向植物的微管中進(jìn)行轉(zhuǎn)移和聚集。
　　二、效應(yīng)分子Avh262通過穩(wěn)定BiPs調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力從而促進(jìn)病原菌的侵柒。本研究發(fā)現(xiàn)保守的大豆疫霉效應(yīng)分子Avh262在大豆疫霉侵染大豆早期上調(diào)表達(dá)。對(duì)疫霉的Avh262進(jìn)行沉默后對(duì)大豆喪失了致病力。Avh262在大豆發(fā)狀根和煙草中的過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)大豆疫霉或辣椒疫

5、霉的侵染。為了探索Avh262抑制植物免疫的分子機(jī)制，通過煙草體內(nèi)Co-IP和LC-MS/MS技術(shù)篩選到了Avh262的靶標(biāo)蛋白Endoplasmic Reticulum(ER)-luminal Binding immunoglobulin Proteins(BiPs)。利用Co-IP和Pull down驗(yàn)證Avh262能夠與大豆的四個(gè)GmBiPs以及煙草中的NbBiP5互作。此外Avh262能夠與BiP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上共定位。本研究發(fā)現(xiàn)過表

6、達(dá)BiP時(shí)，會(huì)有部分BiP蛋白進(jìn)行降解，而Avh262和蛋白酶抑制劑MG132能阻止BiP的降解，本研究證實(shí)Avh262能穩(wěn)定BiP使其維持在較高的蛋白水平。同時(shí)Avh262中的Bips-bindingdomain不僅對(duì)其促進(jìn)侵染的功能是必需的，在Avh262穩(wěn)定BiP的過程中也是必不可少的。BiP在煙草和大豆發(fā)狀根中過表達(dá)能夠促進(jìn)疫霉菌的侵染，而在煙草中沉默NbBiP5則會(huì)增強(qiáng)煙草對(duì)疫霉的抗性，這說明BiPs是一個(gè)植物抗疫霉的負(fù)調(diào)控因

7、子。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)大豆和煙草的BiPs和Avh262能夠抑制BAX引起的細(xì)胞死亡。然而沉默了Avh262的大豆疫霉轉(zhuǎn)化子在侵染大豆時(shí)無法穩(wěn)定BiP并引起植物細(xì)胞死亡，這說明BiP能緩解侵染過程中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力引起的植物細(xì)胞死亡。通過該研究發(fā)現(xiàn)了病原菌效應(yīng)分子抑制植物免疫反應(yīng)的新機(jī)制:在侵染早期大豆疫霉可以分泌效應(yīng)分子Avh262進(jìn)入寄主細(xì)胞，通過穩(wěn)定BiPs來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，降低寄主對(duì)病原菌侵染的敏感度，從而促進(jìn)疫霉菌的

8、定殖。
　　三、Avh172的功能分析和靶標(biāo)篩選。將一個(gè)在侵染過程中高量表達(dá)的IE(Immediately-Early)類效應(yīng)分子Avh172融合RFP后在大豆疫霉中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Avh172-RFP可以在侵染的大豆細(xì)胞中聚集在侵染孔口和吸器周圍。Avh172在煙草細(xì)胞中表達(dá)時(shí)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)利用融合RFP的辣椒疫霉侵染時(shí)，Avh172能夠聚集在辣椒疫霉的吸器和侵染點(diǎn)附近。來自不同生理小種菌株中的Avh172具有不同的定位

9、，但是都能抑制效應(yīng)分子引起的細(xì)胞死亡。Avh172 C端的亮氨酸對(duì)其核仁定位和抑制效應(yīng)分子引起細(xì)胞死亡的功能具有重要的作用。此外將Avh172在大豆發(fā)狀根中進(jìn)行表達(dá)，通過Co-IP和LC-MS/MS技術(shù)篩選到了4個(gè)候選的靶標(biāo)蛋白。
　　四、大豆疫霉與大豆親和互作及非親和互作過程中大豆蛋白質(zhì)組學(xué)分析。本研究利用非親和互作的Williams82-P6497以及親和互作的Williams82-P7076作為實(shí)驗(yàn)材料，通過雙向電泳技術(shù)進(jìn)行

10、大豆疫霉與大豆親和互作及非親和互作的大豆蛋白質(zhì)組學(xué)研究。通過質(zhì)譜分析，本研究共鑒定到了83個(gè)差異表達(dá)的蛋白?；谶@83個(gè)防衛(wèi)反應(yīng)過程相關(guān)蛋白，本研究利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充完善大豆抗病信號(hào)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)模式。分析結(jié)果顯示抗病植物中ROS迸發(fā)、SA途徑以及異黃酮合成相關(guān)基因和蛋白是上調(diào)表達(dá)的，從而說明了在大豆疫霉侵染過程中，大豆的ROS、SA途徑和異黃酮的合成起著至關(guān)重要的作用。本研究可以為今后大豆疫霉與大豆互作中抗病反應(yīng)的分子機(jī)