辣椒疫霉效應(yīng)分子RXLR23的表達(dá)、純化與晶體結(jié)構(gòu)初步研究.pdf

1、辣椒疫霉（Photophthora capsici）是一種具有很大危害性的蔬菜病原菌，侵染寄主范圍廣，包括辣椒、番茄、茄子、瓜類(lèi)等多種茄科及葫蘆科植物。隨著這種病害的發(fā)生率和嚴(yán)重程度在逐年提高，人們對(duì)它的關(guān)注程度也在提高。近年來(lái)，辣椒疫病發(fā)生嚴(yán)重導(dǎo)致辣椒的減產(chǎn)，人們開(kāi)始利用新的途徑來(lái)研究辣椒疫霉的致病機(jī)制，隨之越來(lái)越多的致病基因被發(fā)現(xiàn)。寄主和病原物之間的互作符合基因?qū)蚣僬f(shuō)（ gene-for-gene hypothesis）。當(dāng)抗病

2、植物的抗病基因編碼的蛋白識(shí)質(zhì)別病原物的無(wú)毒基因編碼的蛋白質(zhì)時(shí)，植物的免疫反應(yīng)被激活。無(wú)毒基因也被稱(chēng)為是效應(yīng)基因。隨著辣椒疫霉的基因組由美國(guó)能源部基因研究所（JGI）公布，許多效應(yīng)基因被預(yù)測(cè)，但相關(guān)基因結(jié)構(gòu)生物學(xué)還沒(méi)有研究透徹。
　　近年，卵菌效應(yīng)因子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制成為病原物-寄主互作的熱點(diǎn)問(wèn)題，由于大部分的效應(yīng)蛋白是胞內(nèi)蛋白，而這些蛋白如何進(jìn)入到植物體內(nèi)，仍然還存在問(wèn)題，本文試圖通過(guò)研究轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及植物抗病機(jī)制，為病害生物防治和選育抗病

3、品種奠定重要基礎(chǔ)。
　　本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，從辣椒疫霉基因組中克隆到多個(gè)效應(yīng)基因，成功通過(guò)體外原核表達(dá)和純化獲得高純度和高濃度的蛋白質(zhì)，最終得到一個(gè)效應(yīng)分子蛋白晶體結(jié)構(gòu)，其分辨率為3.2?，具體總結(jié)如下：
　　1.通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，從辣椒疫霉的cDNA中克隆到50多個(gè)無(wú)毒基因，能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)和純化的有3個(gè)基因，其氨基酸序列同源性很低，N端RxLR-deer基序保守及C端功能區(qū)存在很大差異，本研究主要

4、以其中的RLXR23作為主要研究對(duì)象。
　　2.重組蛋白質(zhì) RXLR23通過(guò)親和層析，離子交換層析和分子排阻層析純化，得到穩(wěn)定和高純度蛋白質(zhì)，由于RXLR23結(jié)構(gòu)同源性<30％，不能通過(guò)分子置換法解析結(jié)構(gòu)，需要通過(guò)硒代蛋白來(lái)求解相位，硒代蛋白與native蛋白的表達(dá)和純化方法一致。
　　3.本研究通過(guò)蒸汽擴(kuò)散法中的懸滴法和坐滴法得到初步蛋白晶體，利用懸滴法優(yōu)化最終得到高質(zhì)量的蛋白晶體用于 X衍射，利用單波長(zhǎng)反常散射法求解相位

5、，最終解析RXLR23晶體結(jié)構(gòu)，該蛋白以二聚化的形式行使其功能。
　　4.目前報(bào)道的某些效應(yīng)因子能夠與寄主質(zhì)膜上的3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)結(jié)合，可使效應(yīng)因子直接進(jìn)入到寄主細(xì)胞內(nèi)，本研究試圖通過(guò)RXLR23與PI3P的結(jié)合，在三維空間結(jié)構(gòu)中解釋效應(yīng)分子與之結(jié)合的位點(diǎn)，利用蛋白表達(dá)純化技術(shù)和晶體學(xué)技術(shù)，最終得到復(fù)合物晶體。
　　5.在晶體優(yōu)化過(guò)程中，初始得到的晶體質(zhì)量衍射分辨率只有8?左右，通過(guò)截短，脫水，更換防凍液等方法