辣椒疫霉中8個RxLR效應(yīng)子的功能分析.pdf

1、疫霉菌（Phytophthora）隸屬于卵菌，可以引起植物的嚴(yán)重病害，被稱為植物的“毀滅者”。辣椒疫霉（Phytophthora capsici）是其中一個重要的種，自1922年在墨西哥發(fā)現(xiàn)以來，一直以來都是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的巨大的威脅。據(jù)統(tǒng)計，每年由辣椒疫霉造成的經(jīng)濟損失達(dá)數(shù)十億美元。因辣椒疫霉寄主范圍廣泛、可侵染模式植物擬南芥和本氏煙、便于操作等，已經(jīng)成為卵菌研究的重要模式種。
　　RxLR效應(yīng)子是近年被廣泛研究的一類的胞內(nèi)效應(yīng)子

2、。卵菌幾乎所有病原菌在與寄主互作過程中，都向寄主細(xì)胞分泌大量RxLR效應(yīng)子干擾寄主植物細(xì)胞的正常生理代謝和功能，據(jù)統(tǒng)計辣椒疫霉向寄主分泌的RxLR效應(yīng)子已鑒定到200多個。對這些效應(yīng)子的功能和毒性機制的研究對防治辣椒疫霉病害意義重大。
　　辣椒疫霉中PiAvr3a同源基因的鑒定與功能分析:致病疫霉菌的RxLR效應(yīng)子PiAvr3a可以通過調(diào)節(jié)寄主植物的E3泛素連接酶CMPG1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性來抑制植物的免疫反應(yīng)。我們通過同源序列搜索在

3、辣椒疫霉菌中鑒定到9個PiAvr3a的同源基因（Avr3a-like），并發(fā)現(xiàn)Avr3a-like基因在辣椒疫霉菌和大豆疫霉菌中廣泛存在，表明該類基因可能在疫霉菌致病過程中發(fā)揮重要作用。我們進(jìn)一步通過表達(dá)模式分析、細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)活性檢測和接種分析等發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉菌中的Avr3a-like基因不同成員之間的功能存在分化。其中PcAvh128基因雖然失去了對致病疫霉菌激發(fā)子INF1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抑制能力，卻依然能夠顯著促進(jìn)病原菌的侵染，表明該效

4、應(yīng)子可能通過其他途徑抑制植物的免疫反應(yīng);而PcAvh132能觸發(fā)較弱植物的防衛(wèi)反應(yīng)，限制辣椒疫霉菌的侵染。但與馬鈴薯抗病基因R3a共注射發(fā)現(xiàn)它不能被該抗病蛋白識別，說明本氏煙中可能存在一個有別于R3a的抗病蛋白識別該效應(yīng)子，考慮到辣椒疫霉具有寄主范圍廣的特點，該基因有可能在其他寄主植物上具有毒性功能。其他三個效應(yīng)子沒有發(fā)現(xiàn)任何與PiAvr3a相同的功能，這可能是寄主范圍廣的一種適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果。
　　辣椒疫霉中三個RxLR效應(yīng)子的

5、功能研究:本實驗室前期大規(guī)模篩選了辣椒疫霉的效應(yīng)子，得到數(shù)個能引起植物細(xì)胞死亡的效應(yīng)子包括RxLR22和RxLR25和能夠跟植物抗病相關(guān)蛋白互作的效應(yīng)子，其中包括RxLR172。本研究分別檢測了這三個效應(yīng)子基因在辣椒疫霉侵染本氏煙過程中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)RxLR172在侵染前期階段上調(diào)了16倍，RxLR22和RxLR25分別在中期和中后期下調(diào)了80％和70％。
　　為了確定這三個效應(yīng)子在侵染階段的功能，我們克隆了這三個效應(yīng)子基因并通

6、過PEG介導(dǎo)的疫霉轉(zhuǎn)化技術(shù)在辣椒疫霉中將其沉默，其中RxLR172的2個沉默轉(zhuǎn)化子的菌落直徑分別為野生型的76％和89％，而未沉默對照轉(zhuǎn)化子的菌落直徑為野生型的79％，充分表明RxLR172沉默對辣椒疫霉的生長沒有明顯影響。采用菌絲塊接種法測定致病性結(jié)果顯示RxLR172的2個沉默轉(zhuǎn)化子病斑面積明顯小于野生型，其菌絲定殖量也僅為野生型的59.9％和34.8％，而未沉默對照轉(zhuǎn)化子的菌絲定殖量為野生型的99.2％，表明RxLR172對辣椒疫

7、霉的致病性有影響。
　　RxLR22沉默轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)及菌絲生長速度等方面與野生型LT263無明顯差異;同時接種本氏煙葉片后24 h觀察可見沉默轉(zhuǎn)化子病斑面積顯著小于野生型菌株，采用實時定量PCR分析菌絲定殖量發(fā)現(xiàn)三個沉默轉(zhuǎn)化子分別為野生型的42.3％、9％和44.9％，明顯較低。以上結(jié)果表明RxLR22效應(yīng)子可能增強辣椒疫霉的致病力。RxLR25沉默轉(zhuǎn)化子的菌落直徑分別為野生型的89％和85％，對照轉(zhuǎn)化子為95％，表明其對辣椒