辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)誘導(dǎo)壞死蛋白基因克隆及功能研究.pdf

1、辣椒疫病是在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的一種毀滅性病害，能侵染多種茄科及葫蘆科植物。最早在1922年，Leon Leonian 記載了發(fā)生在墨西哥辣椒疫病，確定其病原為Phytophthora capsici.病原物的成功侵染必須克服寄主的防衛(wèi)系統(tǒng)，進(jìn)而獲取養(yǎng)分進(jìn)行繁殖擴(kuò)大侵染。卵菌病原物能夠分泌效應(yīng)蛋白，引起寄主生理變化，破壞寄主防御系統(tǒng)。
　　 NPP(Necrosis-inducing Phytophthora Protein),

2、也被稱為Nep-1 like proteins是一種典型的效應(yīng)蛋白。許多真菌細(xì)菌及卵菌都可以產(chǎn)生誘導(dǎo)壞死蛋白，特別是卵菌中的疫霉屬基因組存在大量的誘導(dǎo)壞死基因。植物受NPP 處理表現(xiàn)為乙烯釋放，MAP 激酶活化，植保素合成，PR基因誘導(dǎo)表達(dá)，胞質(zhì)Ca2+釋放等防御反應(yīng)。NPP蛋白能夠誘導(dǎo)多種雙子葉植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。NPP蛋白可能在病原微生物中作為毒蛋白，而在一些腐生生物里具備非毒性功能。但是目前對(duì)NPP蛋白功能尚不清楚，本研究主要對(duì)辣椒

3、疫霉誘導(dǎo)壞死蛋白基因家族功能進(jìn)行研究，探索其在疫霉侵染過(guò)程作用機(jī)制。
　　 本研究對(duì)辣椒疫霉菌株SD33 內(nèi)NPP基因家族的致病遺傳機(jī)制及其功能進(jìn)行了分析。
　　 具體內(nèi)容如下：
　　 (1)對(duì)辣椒疫霉高致病性菌株SD33 內(nèi)NPP蛋白基因克隆并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先對(duì)辣椒疫霉基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，特別分析了基因組內(nèi)NPP基因家族信息。以高致病辣椒疫霉菌株SD33 為材料，利用同源序列法克隆了該菌株內(nèi)1

4、8個(gè)NPP基因并進(jìn)行BLAST分析；在利用DNAman軟件對(duì)克隆的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉的NPP蛋白基因序列長(zhǎng)度都在400-1000 bp，并且都有嚴(yán)格保守的‘GHRHDWE'基序，以及C-端相對(duì)保守序列‘QDLIMWDQ'.
　　 (2)分析了18個(gè)NPP基因在菌體內(nèi)的表達(dá)模式并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。根據(jù)18個(gè)基因序列，設(shè)計(jì)特異引物借助RT-PCR分析了菌絲生長(zhǎng)階段基因家族不同基因的表達(dá)模式。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12個(gè)基

5、因在菌絲生長(zhǎng)階段具有活性；同時(shí)下載不同物種的同源基因借助PAUP* 4.0軟件進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示所有來(lái)自卵菌的NPP基因都能聚成一支，而細(xì)菌和真菌的NPP基因卻不能嚴(yán)格分支，說(shuō)明NPP基因是卵菌基因組特有的標(biāo)志，適合用于卵菌進(jìn)化分析。
　　 (3)辣椒疫霉NPP基因在植物體內(nèi)的功能分析。選擇了12個(gè)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，分別構(gòu)建了PVX表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。利用農(nóng)桿菌侵染法接種煙草和辣椒幼苗。記錄每個(gè)基因表達(dá)

6、后所引起兩種植物癥狀變化。結(jié)果顯示辣椒和煙草的癥狀不同，并且各個(gè)基因成員在同一種植物上表達(dá)后的癥狀也是大相徑庭；其中接種煙草的葉片大多出現(xiàn)壞死，黃化癥狀，個(gè)別基因接種沒(méi)有引起植物防衛(wèi)反應(yīng)；而接種的辣椒葉片除了產(chǎn)生上述癥狀外，個(gè)別基因(Pcnpp7和Pcnpp8)的表達(dá)還出現(xiàn)了皺縮和卷曲癥狀。
　　 這說(shuō)明了NPP 家族成員基因功能的多樣性，辣椒疫霉NPP基因可能還具備其它一些新的功能。
　　 (4)辣椒疫霉Pcnpp1

7、潛在活性位點(diǎn)基因體外突變及其突變體在煙草及辣椒中的瞬時(shí)表達(dá)。根據(jù)已報(bào)道的同源NPP蛋白結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)該基因可能有4個(gè)潛在活性位點(diǎn)(D112,H120，D123，E125)，利用OverLap PCR 將4個(gè)活性位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)突變(D112A，H120A,D123A，E125A)以及4個(gè)活性位點(diǎn)同時(shí)突變(112/120/123/125A)。并設(shè)計(jì)引物為這5個(gè)突變體分別構(gòu)建PVX載體(PGR106)，并利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。然后接

8、種煙草辣椒葉片，發(fā)現(xiàn)突變體都不能引起葉片壞死或者黃化。說(shuō)明該基因所選擇的4個(gè)氨基酸是該蛋白的活性位點(diǎn)，該蛋白可能具備酶活性，是一類具有酶活性的效應(yīng)蛋白，但是具體底物未知。
　　 (5)辣椒疫霉NPP基因在病原寄主互作過(guò)程中表達(dá)模式分析。用游動(dòng)孢子懸浮液接種離體辣椒葉片，在接種后1d,3d，5d,7d 取樣然后提取發(fā)病葉片總RNA。反轉(zhuǎn)錄后用熒光定量PCR分析了12個(gè)候選基因在疫霉侵染過(guò)程中的表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)模式分兩種情

9、況。即Pcnpp1，Pcnpp2，Pcnpp6，Pcnpp9和Pcnpp10的表達(dá)模式基本一致，其表達(dá)量在侵染初期成上升趨勢(shì)，都在第3 d的表達(dá)量最高；而Pcnpp3，Pcnpp5，Pcnpp7,Pcnpp8，Pcnpp13，Pcnpp14和Pcnpp15表達(dá)量在整個(gè)侵染過(guò)程成上升趨勢(shì)，在侵染后期達(dá)到峰值。這說(shuō)明NPP蛋白在病原侵染的整個(gè)階段都表達(dá)，病原與植物防御系統(tǒng)間的反應(yīng)不僅局限于侵染初期，還可能持續(xù)整個(gè)侵染過(guò)程。辣椒疫霉誘導(dǎo)壞死基

10、因家族的成員分別在不同的侵染時(shí)期參與克服植物防御反應(yīng)，在致病過(guò)程中起到重要作用。
　　 (6)借助PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，得到了7個(gè)沉默突變體菌株，實(shí)現(xiàn)了10個(gè)候選基因的沉默。根據(jù)各基因序列設(shè)計(jì)基因特異性引物及載體pHAM34 酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了12個(gè)候選基因的沉默表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒及標(biāo)記質(zhì)粒pHspNpt 轉(zhuǎn)入辣椒疫霉SD33 原生質(zhì)體，利用抗生素G418 篩選轉(zhuǎn)化子。得到的轉(zhuǎn)化子在V8 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并記錄生物性狀，包

11、括菌絲生長(zhǎng)速率、菌絲形態(tài)、游動(dòng)孢子產(chǎn)率等等。同時(shí)提取轉(zhuǎn)化子菌體總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，熒光定量PCR分析各候選基因在各轉(zhuǎn)化子內(nèi)的沉默效率。結(jié)果顯示,7個(gè)轉(zhuǎn)化子中除了Pcnpp6和Pcnpp8 外，其余10個(gè)基因的沉默效率都在80％以上，并且出現(xiàn)了多個(gè)基因在同一個(gè)轉(zhuǎn)化子內(nèi)共沉默的現(xiàn)象，這可能是相關(guān)基因同源性較高，發(fā)生了染色體異染色質(zhì)化的原因。此外基因沉默并沒(méi)有引起疫霉菌株生物性狀的變化。
　　 (7)對(duì)轉(zhuǎn)化子的致病性進(jìn)行了檢測(cè)，利用游

12、動(dòng)孢子接種方法處理辣椒幼苗葉片，以野生型菌株為對(duì)照，記錄葉片發(fā)病情況及病斑大小。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默突變體的致病力明顯降低，表現(xiàn)為癥狀產(chǎn)生時(shí)間延緩并且病斑面積明顯變小。說(shuō)明NPP基因沉默導(dǎo)致菌株致病力降低，NPP 在病原侵染過(guò)程中起到重要作用。
　　 綜合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為辣椒疫霉誘導(dǎo)壞死基因是以基因家族形式存在的，在寄主病原互作過(guò)程中扮演著重要角色。NPP基因是卵菌，特別是疫霉菌的一個(gè)典型特征。
　　 辣椒疫霉誘導(dǎo)壞死

13、基因不僅能使植物產(chǎn)生常見(jiàn)的壞死，萎蔫等癥狀，還會(huì)引起寄主葉片皺縮壞死。基因家族各成員的功能存在差異，即使同源性很高的基因基因之間也可能存在顯著的功能差異，對(duì)基因家族功能的研究不能局限于個(gè)別基因功能的分析。NPP蛋白可能是一種具備酶活性的效應(yīng)蛋白，或者可能是一種毒蛋白，但是具體作用底物還是未知的。NPP基因沉默不會(huì)引起菌株表型變化但會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子致病力明顯降低。此外很難實(shí)現(xiàn)基因家族單一成員或者全部成員基因沉默，但是并不影響對(duì)該類基因功能的分