大豆耐低磷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75和GmWRKY6的克隆及功能分析.pdf

1、磷是植物必需礦質(zhì)元素之一，參與植物體內(nèi)生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)移等重要的代謝過程。由于各種原因，土壤中的有效磷含量非常低，且是土壤中最難利用的元素之一，也是制約作物產(chǎn)量的重要因素之一。在長期的進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)進(jìn)化出一套復(fù)雜的途徑來適應(yīng)磷缺乏的機(jī)制，例如改變根系構(gòu)型、分泌大量的有機(jī)酸、與真菌共生、改變代謝途徑等形態(tài)和生化機(jī)制來應(yīng)對(duì)磷缺乏。與此同時(shí)，在分子水平上的研究也在迅速發(fā)展，一些關(guān)鍵的調(diào)控因子已經(jīng)被闡述并發(fā)揮重要的作用，例如轉(zhuǎn)錄

2、因子、磷酸鹽轉(zhuǎn)錄蛋白、非編碼RNA及磷酸鹽誘導(dǎo)基因等。然而這些研究僅限于模式植物，大豆中除轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(GmPT)研究有報(bào)道外，其他均未見報(bào)道，因此開展相關(guān)研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　本研究從大豆中克隆了2個(gè)與擬南芥中耐低磷相關(guān)的AtWRKY75和AtWRKY6同源性比較高的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，分別命名為GmWRKY75和Gm WRKY6，并對(duì)它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證研究，獲得主要結(jié)果如下:
　　1.以

3、擬南芥AtWRKY75和AtWRKY6序列在Phytozome和PGDD數(shù)據(jù)庫中搜索，在大豆中克隆出GmWRKY75和Gm WRKY6序列，其ORF分別為588 bp和1674 bp，分別位于大豆第16號(hào)和第15號(hào)染色體上，與擬南芥AtWRKY75和AtWRKY6的同源性分別為86％和80％。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GmWRKY75與AtWRKY75，GmWRKY6與AtWRKY6具有相同的結(jié)構(gòu)域和相似的基因結(jié)構(gòu)。多重序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析結(jié)果

4、表明，GmWRKY75和Gm WRKY6與擬南芥等物種的WRKY均具有共同的保守結(jié)構(gòu)域，GmWRKY75與AtWRKY75聚為一類，屬于WRKY第Ⅱ亞家族的Ⅱc，GmWRKY6與AtWRKY6聚為一類，屬于WRKY第Ⅱ亞家族的Ⅱb。
　　2.分別在低P、N、K和缺Fe脅迫下對(duì)大豆材料科豐1號(hào)進(jìn)行水培處理，RT-PCR分析結(jié)果表明，GmWRKY75和GmWRKY6在4種處理?xiàng)l件下的表達(dá)趨勢基本一致，先微弱下調(diào)再明顯上調(diào)，但在各處理達(dá)

5、到最高表達(dá)量的時(shí)間點(diǎn)上存在差異，低P處理在48 h時(shí)表達(dá)量最高，低K處理在36h時(shí)表達(dá)量最高，低N處理在24 h時(shí)表達(dá)量最高，缺Fe處理在6h后才緩慢上升。
　　3.構(gòu)建融合表達(dá)載體pJIT166-GFP-GmWRKY75和pJIT166-GFP-Gm WRKY6，通過基因槍法轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究，結(jié)果表明Gm WRKY75和GmWRKY6均定位在細(xì)胞核內(nèi)。
　　4.構(gòu)建植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301-