EGFR靶向單鏈抗體制備及介導(dǎo)siRNA內(nèi)化NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、目的：
　　EGFR-TKIs耐藥引起腫瘤進(jìn)展是當(dāng)前NSCLC治療的主要重點(diǎn)和難點(diǎn)，siRNA可沉默耐藥相關(guān)基因表達(dá)但缺乏靶向性。為提高siRNA的靶向性，本研究設(shè)計(jì)并優(yōu)化EGFR靶向單鏈抗體核苷酸序列，在大腸桿菌中表達(dá)后，純化人源性抗EGFR單鏈抗體(scFv，s-9R)融合蛋白，并對(duì)純化產(chǎn)物的抗原結(jié)合活性、細(xì)胞內(nèi)化活性及核算攜帶能力進(jìn)行鑒定；研究s-9R攜帶siRNA在體內(nèi)、外的抗腫瘤活性。
　　方法：
　　1.根

2、據(jù)人源性抗EGFR抗體輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列，設(shè)計(jì)、合成其單鏈抗體核酸表達(dá)序列，將輕鏈與重鏈核酸序列通過(guò)G4S連接肽相連并在核酸序列末端加入九聚精氨酸及His.tag表達(dá)序列，以構(gòu)建scFv及s-9R融合基因。將測(cè)序正確的融合基因連接入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,誘導(dǎo)表達(dá)后行親和層析純化并酶切GST.tag。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定后，ELISA分析融合蛋白的抗原結(jié)合

3、活性，凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)s-9R與核酸的結(jié)合活性，間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)融合蛋白的內(nèi)化活性。
　　2.scFv及s-9R與EGFR-siRNA，MET-siRNA，KRAS-siRNA及HER2-siRNA分別混合后，加入H1975，H1993，A549，SPC-A1，PC-9及H69細(xì)胞培養(yǎng)液中共孵育，同時(shí)加入/不加入Gefitinib。通過(guò)RT-qPCR，Western blot實(shí)驗(yàn)分析基因表達(dá)水平；通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)

4、、流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)分析EGFR-TKIs細(xì)胞藥物敏感性。
　　3.使用近紅外染料Dylight800 NHS Ester對(duì)單鏈抗體融合蛋白進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)鼠尾靜脈對(duì)H1975細(xì)胞荷瘤裸鼠注射標(biāo)記后的融合蛋白，活體成像觀察融合蛋白在腫瘤部位富集及全身代謝過(guò)程。使用Cy5熒光染料標(biāo)記siRNA，經(jīng)H1975細(xì)胞荷瘤裸鼠鼠尾靜脈注射融合蛋白/Cy5-siRNA,活體成像觀察融合蛋白/Cy5-siRNA在腫瘤部位富集及全身代謝過(guò)程

5、。經(jīng)鼠尾靜脈注射融合蛋白/EGFR-siRNA混合物，并同時(shí)Gefitinib灌胃，觀察裸鼠荷瘤變化；經(jīng)鼠尾靜脈注射融合蛋白/HER2-siRNA混合物，觀察裸鼠荷瘤變化。剝離荷瘤組織后對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，觀察 EGFR、HER2、Ki67表達(dá)情況；對(duì)組織切片進(jìn)行TUNEL標(biāo)記，觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.pGEX-4T-1-scFv及pGEX-4T-1-s-9R質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，IP

6、TG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白scFv及s-9R，經(jīng) SDS-PAGE及Western blot證實(shí)表達(dá)成功；ELISA分析證實(shí)兩條單鏈抗體融合蛋白具有良好的EGFR結(jié)合活性；凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)表明s-9R具有核酸結(jié)合活性；間接免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示兩條單鏈抗體融合蛋白能夠特異性結(jié)合并內(nèi)化入EGFR陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中，而不能內(nèi)化入EGFR表達(dá)陰性腫瘤細(xì)胞中；s-9R可以攜帶FAM-siRNA結(jié)合并內(nèi)化入EGFR陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中，而scFv則無(wú)此

7、功能。
　　2.s-9R可以攜帶EGFR-siRNA，MET-siRNA，KRAS-siRNA及HER2-siRNA內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞中，并下調(diào)細(xì)胞中EGFR、MET、KRAS、HER2基因的表達(dá)；聯(lián)合應(yīng)用Gefitinib后 H1975、H1993及 A549細(xì)胞的凋亡水平較對(duì)照組明顯提高；s-9R/HER2-siRNA混合物可以使 SPC-A1，PC-9增殖能力、克隆形成能力降低，細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期停滯。
　　3.小動(dòng)物活體

8、成像顯示兩條單鏈抗體融合蛋白本身能夠通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)富集于裸鼠荷瘤部位，其中s-9R可以攜帶Cy5/FAM熒光素標(biāo)記的siRNA富集于裸鼠荷瘤部位，并內(nèi)化入瘤細(xì)胞中；經(jīng)鼠尾靜脈注射s-9R/EGFR-siRNA混合物聯(lián)合Gefitinib灌胃，或單獨(dú)經(jīng)鼠尾靜脈注射s-9R/HER2-siRNA混合物可以使裸鼠荷瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，病理切片顯示腫瘤細(xì)胞靶蛋白表達(dá)減少，增殖能力下降，凋亡細(xì)胞增多，荷瘤血管形成能力降低。實(shí)驗(yàn)組裸鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)，移

9、植瘤成瘤率下降，荷瘤體積變小、重量減輕。
　　結(jié)論：
　　所設(shè)計(jì)、構(gòu)建的EGFR靶向單鏈抗體scFv及s-9R可以在體內(nèi)、外特異性的識(shí)別結(jié)合EGFR表達(dá)陽(yáng)性NSCLC細(xì)胞。s-9R可以攜帶特異性siRNA內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞之中抑制靶蛋白表達(dá)，發(fā)揮siRNA的生物學(xué)作用，具有恢復(fù)Gefitinib敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。我們的研究為解決當(dāng)前NSCLC臨床治療中所面對(duì)的酪氨酸激酶抑制劑耐藥問(wèn)題，以及治療以HER