慢病毒介導(dǎo)MMP-3shRNA和Fas-siRNA體外轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、目的：通過慢病毒介導(dǎo)MMP-3shRNA和Fas-siRNA雙基因體外轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞，探討單基因、雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染后對人退變髓核細(xì)胞功能的影響。
　　方法：a.體外培養(yǎng)人退變髓核細(xì)胞，對其進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色、甲苯胺藍(lán)染色，觀察細(xì)胞活力以及細(xì)胞形態(tài)；b.分別根據(jù)人MMP-3基因與Fas基因的mRNA序列合成不同的MMP-3 shRNA與Fas-siRNA序列，與酶切后的慢載體鏈接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)293T細(xì)胞，對慢病毒進(jìn)行包裝。c.慢病毒感

2、染退變髓核細(xì)胞，按照處理方式不同，本實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為：A-空白對照組，B-AAV陰性對照組，C-AAV-MMP-3shRNA組，D-AAV-FassiRNA組，E-AAV-FassiRNA-MMP3shRNA組；d.轉(zhuǎn)染72小時(shí)后CCK8測定各組之間的細(xì)胞增殖情況；72小時(shí)通過熒光定量 PCR檢測轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞mRNA水平變化(MMP-3、Fas以及Ⅱ型膠原、蛋白多糖)；96小時(shí)后通過Western Blot檢測髓核細(xì)胞內(nèi)蛋白水平變化

3、（Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖）。
　　結(jié)果：a.細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)初消化的成人退變髓核細(xì)胞貼壁時(shí)間約為4-5天，初貼壁時(shí)的形態(tài)表現(xiàn)為橢圓形、梭形、多角形，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)向外伸突并隨著時(shí)間延長逐漸伸長。經(jīng)10-14 d以后，90%細(xì)胞呈融合狀態(tài)，形狀類似漩渦狀或火焰狀的細(xì)胞團(tuán)，胞質(zhì)豐富且?guī)в幸欢ㄕ酃庑?，?xì)胞核較大輪廓清楚，呈卵圓形核，有大約1-3個(gè)核仁。經(jīng)過傳代后，第一代細(xì)胞之間的粘附性較原代變差，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形，這與之前的研

4、究相一致原代髓核細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后呈短梭形、多角形等不規(guī)則形狀，胞質(zhì)均呈藍(lán)色，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央或偏向一側(cè)細(xì)胞膜，顏色較周圍胞質(zhì)深。b.退變髓核細(xì)胞原代培養(yǎng)期間存活率在97%以上，第1代培養(yǎng)期間存活率在92-96%之間，第二代仍能維持90%左右,以后細(xì)胞存活率逐漸下降。c.72小時(shí)后用熒光顯微鏡檢測重組慢病毒侵染人退變髓核細(xì)胞后的GFP、BFP表達(dá)情況，結(jié)果顯示各組退變髓核細(xì)胞均已達(dá)到很高的轉(zhuǎn)染效果。d.與空白對照組相比較，F(xiàn)as干擾

5、組、MMP3干擾組及MMP3+Fas雙基因共轉(zhuǎn)組Fas、MMP-3、II型膠原、蛋白多糖的mRNA表達(dá)量增加，且雙基因組效果優(yōu)于單基因組，與空白對照組相比較，F(xiàn)as干擾組、MMP3干擾組及MMP3+Fas雙基因共轉(zhuǎn)組髓核細(xì)胞的蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量增高，且雙基因組效果優(yōu)于單基因組，以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.通過基因沉默技術(shù)干擾髓核細(xì)胞內(nèi)Fas、MMP-3基因的表達(dá)，可以有效抑制髓核細(xì)胞的凋