慢病毒介導survivin體外轉染MSCs實驗研究.pdf

1、目的：單純未轉染干細胞移植體內后生存能力低下嚴重限制了其增殖能力。本研究旨在探討存活素(Survivin,Svv)基因修飾的骨髓間充質干細胞(MSCs)在離體微環(huán)境中延長生存能力的機制,為新的干細胞抗凋亡移植策略提供理論依據(jù)。
　　 方法：分離提取幼年C57BL/6小鼠骨髓細胞,采用全骨髓法培養(yǎng)擴增骨髓間充質干細胞,取第11代細胞進行試驗。未轉染細胞進行連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)并繪制生長曲線;同時應用流式細胞技術檢測細胞表面標志物SCA-1

2、、CD29、CD34、CD44和CD117;行成骨、成脂誘導分化測定;rt-PCR測定細胞內survivin表達情況。制備DNA-Lipofectamine2000復合物,同時轉染到293FT細胞中收集含有病毒的培養(yǎng)液,制備Svv重組慢病毒和空白對照病毒,測定病毒滴度;Svv慢病毒和空白病毒分別轉染骨髓間充質干細胞并測出轉染率接近大于90％時的MOI值;分別進行轉染后成骨誘導分化測定;并運用rt-PCR比較轉染前后間充質干細胞內surv

3、ivin表達變化情況。
　　 結果：培養(yǎng)出的細胞呈長梭成纖維細胞樣,經流式細胞儀檢測細胞表面高表達SCA-1、CD29、CD34、CD44,低表達CD117;細胞曲線顯示傳代細胞培養(yǎng)第1-3 d生長緩慢,第4 d生長加快并在第7 d達到高峰;成骨誘導20 d經茜素紅染色呈紅色結節(jié),成脂誘導14 d油紅O染色顯示有大量脂質沉淀;rt-PCR結果顯示survivin mRNA陽性表達。成功包裝出Svv慢病毒和空白病毒,實驗組病毒滴度

4、為7.1×107TU/ml,空白病毒組病毒滴度為8.3×107 TU/ml;轉染率接近大于90%時的MOI值Svv慢病毒和空白病毒分別為28.4和8.3;轉染后的Svv慢病毒和空白病毒均能向成骨分化;同時rt-PCR結果顯示轉染后明顯過表達survivin。
　　 結論：全骨髓培養(yǎng)法可以培養(yǎng)出大量骨髓間充質干細胞,同時survivin在小鼠骨髓間充質干細胞中正常表達,提示可能參與骨髓間充質干細胞抗凋亡過程;慢病毒轉然后骨髓間充質