慢病毒轉(zhuǎn)染手冊

1、慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力?；靖攀雎《据d體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究

2、，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。慢病毒的應(yīng)用目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞

3、中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因為RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶polyA尾。當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個或5個T時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個U。U6和H1RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)

4、構(gòu)（stemloop）。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄然后兩條鏈互補結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNAshRNA)載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4～5T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4個U3’突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從

5、中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體。慢病毒載體感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂細(xì)胞，但在干細(xì)胞中表達(dá)效率低表達(dá)豐度高水平表達(dá)高水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時間快（12天）慢（24天）快（12天）滴度滴度高達(dá)1012pfuml最高可達(dá)109－10TUml最高可達(dá)109－10TUml克隆容量可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降

6、低可插入不超過6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性動物模型不能得到轉(zhuǎn)基因動物可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，效率達(dá)50以上可以，但很難啟動子可以更換特異性啟動子可以更換特異性啟動子不需要啟動子能否用于MIRCNA可以可以不可以能否用于四環(huán)素誘導(dǎo)不可以TETONTETOFF不可以系統(tǒng)的目的與意義●對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為