串珠素shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對成纖維細(xì)胞增殖能力的影響.pdf

1、1、目的：
　　 術(shù)后瘢痕是手術(shù)常見的并發(fā)癥之一,在腰椎術(shù)后患者,硬膜外瘢痕的形成是腰椎手術(shù)失敗綜合征(FBSS)的重要成因之一。瘢痕的形成是創(chuàng)傷修復(fù)的結(jié)果,其形成伴隨著炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞增殖分化、毛細(xì)血管形成、肉芽組織生成、膠原纖維形成沉積,等一系列復(fù)雜的過程。而成纖維細(xì)胞是瘢痕形成的主要效應(yīng)細(xì)胞,所以對成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控對于控制瘢痕的形成顯得尤為重要。雖然人們對其病因及治療作了大量研究,但至今仍未獲得有效的治療

2、手段。隨著基因工程技術(shù)迅猛發(fā)展,使得基因治療成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域全新的治療手段,特別是前幾年才被發(fā)現(xiàn)的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù),為分子醫(yī)學(xué)帶來翻天覆地的變化。本文將采用以慢病毒為載體的RNAi技術(shù),從基因治療的角度,以體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T13為研究對象,探索病理性瘢痕基因治療的新策略。
　　 2、方法：
　　 培養(yǎng)小鼠NIH3T3細(xì)胞,用MOI(感染復(fù)數(shù))=10,30,50的GFP

3、LentiviralParticles感染NIH3T3細(xì)胞,轉(zhuǎn)染1周后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況,從而判斷慢病毒載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞所需的合適MOI值及GFP表達(dá)時(shí)間。確定了LV載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞合適的MOI值后,以此條件進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)染。用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。分別以RT-PCR、Westenblot及MTT(四基噻唑基四唑)法來檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)及細(xì)胞增殖水平的差別,以探討慢病毒載體轉(zhuǎn)染對目的細(xì)胞活力的影

4、響。
　　 3、結(jié)果：
　　 1)光顯微鏡觀察結(jié)果:
　　 a)對于實(shí)驗(yàn)中的NIH3T3細(xì)胞,GFP表達(dá)隨MOI值的增大而變強(qiáng)。其中MOI=30時(shí)GFP表達(dá)已比較滿意。
　　 b)總體上,LV-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞4天后GFP表達(dá)已接近高峰。
　　 2)PCR及Westenblot檢測結(jié)果
　　 串珠素mRNA和蛋白質(zhì)水平在shRNA組低表達(dá),在對照組和GFP組高表達(dá),shRNA組與對照組比較

5、,shRNA組與GFP組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),對照組與GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3)MTT法染色細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:
　　 在DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)下,對照組與GFP組細(xì)胞增殖接近正常,但shRNA組細(xì)胞的增殖與GFP組和對照組相比明顯減低。
　　 4、結(jié)論：
　　 通過本實(shí)驗(yàn)掌握了慢病毒載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法。對于本實(shí)驗(yàn)NIH3T3細(xì)胞,MOI=30比較合適,已能達(dá)