腺病毒與慢病毒載體轉染離體兔角膜基質細胞的對比研究.pdf

1、目的：利用增強型綠色熒光蛋白(EGFP)為報告基因,觀察比較腺病毒與慢病毒載體分別介導EGFP對體外培養(yǎng)的兔角膜基質細胞的轉染效率及對細胞的安全性,探討較優(yōu)一種病毒載體作為角膜基因治療載體的可行性,為后繼采用該病毒載體介導目的基因轉染治療屈光術后角膜haze生成奠定基礎。
　　 方法：離體兔角膜基質細胞的原代、傳代培養(yǎng)及鑒定；實驗分為轉染組和對照組,轉染組用慢病毒載體攜帶增強型綠色熒光蛋白報告基因(LV-EGFP)與腺病毒載體攜

2、帶增強型綠色熒光蛋白基因(AV-EGFP)分別感染離體兔角膜基質細胞(RCSCs),對照組則加入空白培養(yǎng)液,在不同感染復數(MOI)及感染后不同的時間段在倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況,流式細胞技術(FCM)檢測轉染效率；RT-PCR檢測轉染組和對照組EGFP的mRNA表達情況；光鏡及電鏡技術觀察轉染組細胞形態(tài)及超微結構的變化；MTT比色法檢測兩種病毒載體對角膜基質細胞活性的影響。
　　 結果：⑴AV-EGFP感染基質細

3、胞后從24-48小時開始就可見明顯的綠色熒光,起始時間早于LV-EGFP轉染組。隨著MOI值增大,兩轉染組轉染效率均增高。轉染后第3天,慢病毒轉染組在MOI=1000時轉染效率可達61％,而腺病毒轉染組轉染效率為40％。在同一MOI值下,慢病毒較腺病毒載體轉染效率更高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑵RT-PCR檢測兩轉染組均有.EGFP的mRNA表達,而對照組無表達。AV-EGFP與LV-EGFP轉染組相比,AV-EGFP轉染組的

4、EGFP mRNA表達偏低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑶電鏡結果顯示AV-EGFP轉染組在MOI=104時及LV-EGFP轉染組在MOI=1000時轉染組細胞出現細胞凋亡,而慢病毒在MOI=500時,轉染組細胞超微結構未見明顯異常。⑷慢病毒載體在MOI≤500時,腺病毒載體在MOI≤1000時,兩種病毒對細胞活性的影響,轉染組分別與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義。慢病毒載體在MOI≥1000,腺病毒載體在MOI≥104轉染組與對照

5、組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),病毒載體抑制細胞的活性,細胞存活率下降。且當MOI=104時,慢病毒載體轉染組與腺病毒載體轉染組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),兩病毒載體對細胞活性影響無差別,均導致細胞活性下降。
　　 結論：①腺病毒與慢病毒載體均可有效轉染離體兔角膜基質細胞,以慢病毒載體轉染效率更高。②腺病毒最適感染復數為1000,其轉染效率在第三天可達40％,慢病毒最適感染復數為500,其轉染效率在第三天可達