重組腺病毒載體搭載TIMP-3基因?qū)ν米甸g盤基質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的: 考察腺病毒載體搭載的人TIMP-3(RAdTIMP-3)對兔椎間盤內(nèi)重要基質(zhì)代謝的影響，及其是否對椎間盤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用。 方法: ①培養(yǎng)293細(xì)胞并分別轉(zhuǎn)染重組腺病毒RAdLac-Z和RAdTIMP-3，病毒轉(zhuǎn)染后分別進(jìn)行擴(kuò)增，分離，純化及進(jìn)行病毒滴度測定。采用PCR方法對純化后病毒進(jìn)行鑒定并保存病毒液備用。 ②將30只健康日本大白兔，隨機(jī)分成5組，每組6只，分別對兔L4-L5、L5-L6椎間盤內(nèi)注射

2、生理鹽水（第1組）、RAdLac-Z（第2組）、RAdTIMP-3（第3、4、5組）各25μl。第1、2組為對照組，第3、4、5組為干預(yù)組，按實(shí)驗(yàn)預(yù)定時(shí)間處死動物，獲取椎間盤組織。 ③Tunel法檢測椎間盤細(xì)胞凋亡情況，以及藏紅O-快綠染色考察aggrecan的含量及分布情況；采用RT-PCR方法，對各組椎間盤組織內(nèi)TIMP-3、聚集蛋白聚糖（aggrecan）以及II型膠原的表達(dá)量進(jìn)行檢測。 結(jié)果: ①RAdL

3、ac-Z及RAdTIMP-3病毒能夠轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并擴(kuò)增，β-半乳糖苷酶原位染色顯示陽性；病毒經(jīng)純化后滴度可達(dá)2.02×1012VP。 ②椎間盤組織Tunel法染色顯示，各組凋亡細(xì)胞比例為12.6％、12.9％、13.5％，12.8％和13.2％，治療組與對照組無明顯差異。 ③臧紅O-快綠染色顯示干預(yù)組椎間盤顯色強(qiáng)度明顯高于對照組。 ④RT-PCR顯示，注射目的基因的干預(yù)組TIMP-3、aggrecan及II型