慢病毒介導的MMP-3shRNA轉染對人退變髓核細胞的生物學效應.pdf

1、目的：體外篩選設計并合成的抑制效率最佳的MMP-3shRNA慢病毒載體，并觀察其對人退變髓核細胞的生物學效應。
　　方法：采用酶序貫消化法對臨床腰椎間盤突出癥患者需行摘除術來源的髓核組織進行分離、單層原代細胞培養(yǎng)，應用細胞免疫組化法、細胞免疫熒光法等方法對髓核細胞進行鑒定；根據(jù)人MMP-3基因mRNA序列設計合成4對不同的MMP-3 shRNA序列，與酶切后LV3載體鏈接并轉入感受態(tài)細胞，通過PCR和基因測序對擴增的陽性克隆進行鑒

2、定，對慢病毒進行包裝和滴度測定；通過熒光定量PCR、Western Blot分別檢測轉染人退變髓核細胞后MMP-3、Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因和蛋白質水平的變化，從而篩選最佳抑制序列慢病毒載體及其對人退變髓核細胞的生物學效應。
　　結果：原代髓核細胞呈三角形、多角形或短梭形等不規(guī)則形狀，細胞核較大，培養(yǎng)約3周時，原代髓核細胞匯合可達80％以上；蘇木精-伊紅染色細胞核呈藍色，胞漿呈淡紅色，甲苯胺藍染色胞核成深藍色，胞漿呈淡藍色，細胞免疫

3、組化及細胞免疫熒光Ⅱ型膠原分別呈黃褐色和綠色熒光。經(jīng)酶切鑒定陽性擴增片段正確，基因測序顯示與設計序列完全相符，滴度檢測顯示大于1x108TU/ml。MMP3shRNA慢病毒轉染72和96小時后從 MMP-3基因和蛋白水平綜合篩選得出MMP-3shRNA3為最佳抑制序列（P<0.05）。MMP-3shRNA3轉染人退變髓核細胞5天后檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA及蛋白水平均增加（P<0.01）。
　　結論：成功構建并篩選出抑制效率最