慢病毒載體介導(dǎo)的CXCR7shRNA對(duì)結(jié)腸癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及多個(gè)趨化因子和受體的異常表達(dá)，CXCL12和受體CXCR4是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。最近在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)僅抑制CXCR4的表達(dá)，只能部分地阻斷惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7(孤兒受體RDCl)與CXCL12具有高親和力，表達(dá)于許多腫瘤細(xì)胞系，直接參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CXCR7信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制還不確切，推測(cè)可能是通過(guò)結(jié)構(gòu)性激活機(jī)制來(lái)活化細(xì)胞，此結(jié)構(gòu)性激活機(jī)制通過(guò)可逆性地與配體結(jié)合的形式活

2、化。 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CXCR7能提高腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、粘附和侵襲能力。導(dǎo)入CXCR7序列的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB435s，體內(nèi)成瘤性顯著提高；而CXCR7siRNA可使乳腺癌細(xì)胞4T1體內(nèi)成瘤性顯著降低。用CXCR7的小分子拮抗劑也可使腫瘤生長(zhǎng)顯著減小。 目前研究CXCR7對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響僅限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等。本文擬展開(kāi)“CXCR7與結(jié)腸癌”的實(shí)驗(yàn)研究，首先假定CXCR7是人結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因子，

3、在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移相關(guān)，靶向沉默CXCR7的表達(dá)能有效抑制結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展，由此實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)如下： 1.研究CXCR7在人結(jié)腸癌組織、正常結(jié)腸組織以及結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，探討其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度的關(guān)系。 2.設(shè)計(jì)、篩選有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞CXCR7表達(dá)的siRNA序列，并構(gòu)建重組慢病毒CXCR7shRNA(lentiviraus-CXCR7shRNA，LV-CXCR7sh

4、RNA)表達(dá)載體。 3.研究靶向CXCR7的慢病毒shRNA表達(dá)載體對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移活性的調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞水平探討CXCR7對(duì)結(jié)腸癌的生物學(xué)行為的影響。 4.研究靶向CXCR7的慢病毒shRNA表達(dá)載體對(duì)人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠瘤體的治療作用，在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)CXCR7對(duì)結(jié)腸癌的生物學(xué)行為的影響。 第一章 CXCR7在人結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其意義 目的 研究CXCR7在人結(jié)腸癌組

5、織、正常結(jié)腸組織以及結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。 方法 1.CXCR7在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平：分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)和Westernblotting(WB)方法測(cè)定人結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)合臨床資料分析CXCR7的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度的關(guān)系。 2.CXCR7在

6、人結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平：FQ-PCR方法測(cè)定CXCR7mRNA在2種人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480中的表達(dá)水平，選擇其中CXCR7表達(dá)較高的一株結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)入后續(xù)部分的實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果 1.人結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中CXCR7mRNA相對(duì)表達(dá)的中位數(shù)分別為1.14和0.22，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)腸癌組織中CXCR7蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.245±0.059，與正常結(jié)腸組織中的0.17±0.064相比

7、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.在伴有和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CXCR7mRNA相對(duì)表達(dá)的中位數(shù)分別為1.455和0.74，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CXCR7蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.276±0.055和0.2±0.026，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.在不同分化程度的腫瘤組織中，CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 4.CXCR7mRNA在人結(jié)腸癌細(xì)

8、胞系HT-29中的表達(dá)水平高于在SW-480中的表達(dá)水平。 結(jié)論 1.CXCR7在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著增高，并且在伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)。 2.在不同分化程度的結(jié)腸癌組織中，CXCR7的表達(dá)無(wú)差異。 3.HT-29細(xì)胞中CXCR7mRNA的表達(dá)較高。 第二章構(gòu)建CXCR7shRNA重組慢病毒表達(dá)載體 目的 篩選有效的CXCR7siRNA序列，構(gòu)建重組慢病毒CX

9、CR7shRNA表達(dá)載體。 方法 1.篩選有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞CXCR7表達(dá)的siRNA序列：設(shè)計(jì)3個(gè)針對(duì)CXCR7靶基因序列的siRNA序列，分別構(gòu)建重組shRNA質(zhì)粒，小量包裝shRNA慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，F(xiàn)Q-PCR和WB方法分別測(cè)定轉(zhuǎn)染后HT-29細(xì)胞中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)水平，證實(shí)沉默效果，篩選出有效靶點(diǎn)。 2.構(gòu)建LV-CXCR7shRNA:用所篩選出的siRNA序列構(gòu)

10、建重組shRNA質(zhì)粒，大量包裝LV-CXCR7shRNA，并檢測(cè)病毒滴度。 結(jié)果 1.FQ-PCR檢測(cè)3個(gè)siRNA序列對(duì)CXCR7基因的沉默效應(yīng)，其中以LV-CXCR7shRNA-2下調(diào)最為明顯(72％)，WB檢測(cè)結(jié)果與其一致。 2.選擇沉默效應(yīng)為72％的siRNA序列包裝shRNA慢病毒載體，測(cè)定病毒滴度為4.Oxl08TU/mL。 結(jié)論 成功構(gòu)建慢病毒CXCR7shRNA表達(dá)載體，可有效下調(diào)

11、人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)。 第三章靶向抑制CXCR7的表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的 研究靶向抑制CXCR7的表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移活性的影響。 方法 1.將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29分為3組：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入LV-CXCR7shRNA;陰性對(duì)照組加入LV-shRNA陰性對(duì)照；空白對(duì)照組不予任何處理。 2.FQ-PCR和W

12、B方法分別測(cè)定各組細(xì)胞CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)水平 3.細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)( MTT)、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖和遷移活力。 結(jié)果 1.CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)水平：FQ-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組CXCR7mRNA的相對(duì)表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，而兩組對(duì)照組之間相比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。WB結(jié)果與FQ-PCR一致，提示LV-CXCR7shRNA對(duì)HT-

13、29細(xì)胞的CXCR7基因沉默有效。 2.細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(MTT)：結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較平緩，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較空白對(duì)照組低平，提示靶向沉默CXCR7的表達(dá)明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)慢病毒載體本身具有的潛在細(xì)胞毒性。 3.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組穿透濾過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，兩對(duì)照組

14、比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示靶向抑制CXCR7的表達(dá)明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的遷移活性。 結(jié)論 靶向沉默CXCR7的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移活性 第四章 CXCR7shRNA重組慢病毒表達(dá)載體對(duì)人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠皮下種植瘤的治療作用 目的 探討慢病毒載體介導(dǎo)的CXCR7shRNA對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，為進(jìn)一步研究以CXCR7為靶點(diǎn)的結(jié)腸癌基因治療奠定基礎(chǔ)。

15、 方法 1.建立人結(jié)腸癌荷瘤鼠模型，計(jì)算成瘤率。 2.動(dòng)物分組：將人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組，每組8只：治療組：瘤體內(nèi)注射LV-CXCR7shRNA50UL;陰性對(duì)照組：瘤體內(nèi)注射LV-shRNA negative control50μL;空白對(duì)照組：瘤體內(nèi)注射PBS50μL。 3.給藥后各組裸鼠每3天測(cè)量荷瘤裸鼠腫瘤體積，繪制瘤體增長(zhǎng)曲線。 4.24天后處死動(dòng)物，取出種植瘤，測(cè)量其體積、重量，計(jì)

16、算抑瘤率。 5.FQ-PCR和WB方法分別測(cè)定腫瘤組織的CXCR7mRNA和CXCR7蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 1.人結(jié)腸癌荷瘤鼠模型構(gòu)建成功，成瘤率為100％。 2.與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，治療組瘤體的增長(zhǎng)速度慢、體積小(P<0.05)，重量減輕(P<0.05)，抑瘤率分別為38％和34.04％。 3.治療組的瘤體組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05