Salubrinal在人髓核細(xì)胞中抑制IL-17介導(dǎo)的椎間盤(pán)退變機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　腰椎間盤(pán)退變疾病是骨科臨床常見(jiàn)病，其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分下降，水分減少，膠原比例變化等?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在這一過(guò)程中扮演重要角色。MMPs一般通過(guò)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等組織細(xì)胞產(chǎn)生，是一類(lèi)Ca和Zn依賴(lài)的蛋白水解酶家族，參與降解全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)成分。有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)主要來(lái)源于軟骨細(xì)胞，具有降解Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的作用，因

2、此，基質(zhì)金屬蛋白酶13在基質(zhì)降解過(guò)程里可以發(fā)揮雙重作用。以往的研究表明，MMP-13在炎性介質(zhì)（白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等）介導(dǎo)的人椎間盤(pán)退變過(guò)程中起重要作用。但是關(guān)于白介素-17（IL-17）與MMP-13在椎間盤(pán)退變過(guò)程中的關(guān)系尚未有相關(guān)報(bào)道。Salubrinal是真核起始因子2α(eIF2α)去磷酸化的抑制劑，能夠提升eIF2α的磷酸化水平，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。最近的研究表明，salu

3、brinal具有促進(jìn)骨愈合、抑制骨質(zhì)疏松、抑制骨細(xì)胞和成骨細(xì)凋亡及抑制骨關(guān)節(jié)炎等骨保護(hù)作用，但是關(guān)于salubrinal與椎間盤(pán)退變的關(guān)系尚未有人報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將研究salubrinal是否可抑制IL-17介導(dǎo)的椎間盤(pán)退變過(guò)程。
　　研究目的：
　　1.本實(shí)驗(yàn)將研究IL-17在椎間盤(pán)退變過(guò)程中對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-13和細(xì)胞外基質(zhì)成分的調(diào)節(jié)。
　　2.研究真核起始因子2α去磷酸化的抑制劑salubrinal，是否可以抑制IL

4、-17介導(dǎo)的上述過(guò)程。
　　研究方法：
　　1。選取2014年2月-2014年9月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院骨外科住院住院并經(jīng)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查確診為腰椎間盤(pán)突出癥患者。20個(gè)取自經(jīng)椎間孔融合術(shù)及后路腰椎椎間融合術(shù)患者的椎間盤(pán)，所有椎間盤(pán)按Pfirrmann評(píng)分屬于非退變組，椎間盤(pán)分離髓核組織后，提取原代髓核細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。
　　2.用蛋白免疫印跡和RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)不同濃度和不同時(shí)間IL-17刺激下，髓核細(xì)胞中MMP-

5、13、Ⅱ型膠原(COL2A1)、Ⅰ型膠原(COL1A1)及聚集蛋白多糖(ACAN)的表達(dá)。
　　3.用蛋白免疫印跡和免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)IL-17刺激下，NF-κB通路是否被激活。另外，用蛋白免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)IL-17或salubrinal刺激下，eIF2α的表達(dá)情況。
　　4.用蛋白免疫印跡和RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)在salubirnal或NF-κB通路的抑制劑與IL-17共同刺激下，髓核細(xì)胞中MMP-13、Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠

6、原和聚集蛋白多糖的表達(dá)，以及NF-κB通路是否被激活。
　　研究結(jié)果：
　　1.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，IL-17刺激髓核細(xì)胞，使MMP-13和Ⅰ型膠原表達(dá)升高，并降低Ⅱ型膠原和聚集蛋白多糖的表達(dá)，RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，IL-17刺激髓核細(xì)胞，使MMP-13表達(dá)升高，并降低Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原和聚集蛋白多糖的表達(dá)。
　　2.免疫印跡實(shí)驗(yàn)及免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，IL-17刺激髓核細(xì)胞激活了NF-κB通路。另外，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，

7、IL-17同時(shí)使eIF2α的表達(dá)升高。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，在IL-17和BAY11-7082共同刺激下，eIF2α磷酸化水平并沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.Salubrinal和NF-κB通路抑制劑BAY11-7082可以抑制IL-17激活的NF-κB通路。同時(shí)，免疫印跡技術(shù)表明，salubrinal和BAY11-7082抑制了IL-17導(dǎo)致的MMP-13和Ⅰ型膠原表達(dá)升高，以及Ⅱ型膠原、聚集蛋白多糖表達(dá)下降。RT-PC