IL-17A在退變椎間盤炎癥反應及股骨頭壞死軟骨退變中的作用及機制研究.pdf

1、本研究分為三部分:第一部分旨在研究IL-17A和COX2在椎間盤組織及髓核細胞中表達;第二部分旨在研究IL-17A對髓核細胞致炎作用的相關機制;第三部分為IL-17A在股骨頭壞死軟骨退變中的作用及機制研究
　　第一部分:IL-17A和COX2在椎間盤組織及髓核細胞中表達的研究
　　研究目的:檢測椎間盤突出癥患者椎間盤組織中Th17相關細胞因子IL-17A及疼痛相關因子COX2的表達，研究髓核細胞中IL-17A對COX2及其下

2、游分子PGE2的作用。
　　研究方法:選取2014年2月-2015年4月于山東大學齊魯醫(yī)院住院行手術治療的腰椎間盤突出癥患者56例為實驗組，以及行手術治療的脊柱外傷患者8例為對照組。取患者術中切除的部分腰椎間盤組織，通過免疫組織化學法檢測2組患者椎間盤組織中的IL-17A和COX-2的表達。體外實驗:選擇11例腰椎間盤突出癥患者髓核組織提取原代髓核細胞進行培養(yǎng)，取第三代髓核細胞加入IL-17A進行培養(yǎng)，設置IL-17A濃度梯度及時

3、間梯度，收集細胞培養(yǎng)上清液，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測PGE2的濃度，收集髓核細胞，提取細胞總蛋白，通過蛋白質免疫印跡實驗(Western Blot)檢測髓核細胞中COX2的表達情況。
　　研究結果:1.免疫組織化學結果顯示實驗組患者椎間盤組織中IL-17A及COX-2均有表達，表達水平較對照組明顯提高，并存在統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　2.IL-17A刺激原代髓核細胞后，能夠明顯提高髓核細胞中COX-2和

4、PGE2的表達，并存在明顯的濃度依賴性和時間依賴性。
　　研究結論:IL-17A能夠誘導COX2和PGE2的表達。在多種疾病中，COX2和PGE2在炎癥過程及疼痛中扮演重要角色，而COX2是PGE2合成的關鍵性限速酶，IL-17A可能通過誘導COX-2的表達，進一步導致PGE2生成，從而在退變腰椎間盤炎癥反應及腰背部疼痛中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分:IL-17A對髓核細胞致炎作用相關機制的研究
　　研究目的:研究IL

5、-17A對髓核細胞中MAPK信號轉導通路和轉錄因子AP-1的作用，探討MAPK信號通路和轉錄因子AP-1在IL-17A誘導的COX2和PGE2表達中的調控機制。
　　研究方法:使用體外培養(yǎng)的原代髓核細胞，加入濃度為100ng/ml的IL-17A進行刺激，western blot檢測不同時間內p38 MAPK、JNK MAPK、ERK1/2 MAPK的活化表達情況;用IL-17A分別刺激p38、JNK、ERK1/2信號通路抑制劑預處

6、理髓核細胞，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中PGE2的濃度，提取髓核細胞總蛋白，western blot檢測COX2的表達情況;用IL-17A刺激原代髓核細胞以及p38MAPK、JNK MAPK抑制劑處理后的髓核細胞，免疫熒光檢測髓核細胞中磷酸化c-jun的表達情況，提取細胞核蛋白，western blot檢測c-jun和c-fos的表達;用IL-17A刺激AP-1抑制劑預處理的髓核細胞，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中PGE2的濃度，

7、Western blot檢測COX-2的表達情況。
　　研究結果:1.IL-17A可刺激髓核細胞激活p38 MAPK和JNK MAPK信號轉導通路。在原代髓核細胞中，IL-17A能夠迅速誘導P38 MAPK和JNK MAPK的磷酸化，隨著時間延長，二者磷酸化水平逐漸降低，但是IL-17A刺激不能導致ERK1/2 MAPK的磷酸化。
　　2.p38 MAPK和JNK MPAK抑制劑可顯著抑制IL-17A誘導的COX2和PGE2

8、的表達，Western blot和ELISA結果分別顯示，p38 MAPK和JNK MAPK抑制劑單一使用和聯(lián)合使用，均能顯著降低COX2和PGE2的表達，但是ERK1/2 MAPK抑制劑對COX2和PGE2的表達無明顯影響。這說明，IL-17A通過激活p38 MAPK和JNK MAPK信號通路而上調COX2和PGE2的表達，以發(fā)揮其致炎作用。我們還發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK和JNK MAPK抑制劑二者單一使用時，均可導致COX2和PGE2

9、的表達下降80％以上，一條通路被阻斷的效果并不能夠被另一條的激活所代償，這說明P38 MAPK和JNK MAPK二者相互獨立，IL-17A發(fā)揮作用需二者的同時激活，這可能與下游的轉錄因子活化有關。
　　3.對MAPK信號通路下游轉錄因子AP-1進行研究，免疫熒光結果顯示，未處理的髓核細胞中，c-jun磷酸化水平較低，IL-17A刺激后，髓核細胞中c-jun的磷酸化水平明顯增高，而JNK抑制劑可阻斷IL-17A誘導的c-jun磷酸化

10、;western blot結果表明，IL-17A能夠顯著激活c-jun和c-fos二者在細胞核內的表達，加入MAPK抑制劑后，p38 MAPK抑制劑可抑制c-fos的細胞核內表達，但對c-jun無明顯影響，而JNK MAPK的抑制劑可以抑制c-jun的核內表達，但對c-fos無影響。
　　4.AP-1抑制劑可阻斷IL-17A上調COX2和PGE2表達的作用，這說明IL-17A對髓核細胞的作用，有賴于轉錄因子AP-1的活化。

11、　　研究結論:1.IL-17A可以激活P38 MAPK和JNK MAPK信號轉導通路;
　　2.IL-17A誘導COX2和PGE2的表達有賴于P38 MAPK和JNK MAPK信號通路的激活，并且，p38 MAPK和JNK MAPK信號通路需同時激活，IL-17A方可發(fā)揮其致炎作用。
　　3.IL-17A可以誘導髓核細胞內c-jun的磷酸化，并上調c-fos和c-jun在髓核細胞內的表達，這證明了IL-17A可以激活髓核細胞

12、中轉錄因子AP-1的表達。
　　4.在髓核細胞中，轉錄因子AP-1參與了IL-17A上調COX2蛋白的表達及其下游產(chǎn)物PGE2的表達過程。
　　5.IL-17A在髓核細胞內可通過誘導P38 MAPK磷酸化，上調c-fos在細胞核內的表達，通過誘導JNK MAPK的磷酸化，而上調c-jun磷酸化和表達，c-fos和c-jun組成c-fos/c-jun異源二聚體而形成活化的轉錄因子AP-1，從而激活COX2的轉錄表達，進而促進P

13、GE2的產(chǎn)生，從而誘導髓核細胞炎癥反應。
　　6.IL-17A通過p38/c-fos和JNK/c-jun途徑激活轉錄因子AP-1，從而上調COX2的表達和PGE2的生成，從而在椎間盤組織中發(fā)揮致炎作用。
　　第三部分: IL-17A在股骨頭壞死軟骨退變中的作用及機制研究
　　研究目的:研究股骨頭壞死髖關節(jié)液中炎癥介質IL-17A的表達，及壞死股骨頭軟骨組織中ADAMTS-7的表達與軟骨退交情況的關系，并探討IL-17A

14、對ADAMTS-7表達的影響及可能作用機制。
　　研究方法:選取于山東大學齊魯醫(yī)院住院行手術治療的股骨頭壞死患者34例為實驗組，及股骨頸骨折患者14例為對照組。使用ELISA法檢測股骨頭壞死患者關節(jié)液中IL-17A的表達情況;HE染色和番紅固綠染色評價軟骨退變情況;免疫組織化學染色研究ADAMTS-7和p-NFκB p65的表達水平;提取原代軟骨細胞，加入IL-17A刺激后，檢測軟骨細胞中ADAMTS-7的表達水平及NFκB p6

15、5的活化水平。
　　研究結果:1.股骨頭壞死髖關節(jié)液ELISA結果顯示，股骨頭壞死關節(jié)液中IL-17A含量明顯增加。
　　2.軟骨HE染色和番紅-固綠染色結果顯示ONFH患者股骨頭軟骨隨病情進展逐漸發(fā)生退行性改變。
　　3.免疫組織化學、Western Blot和RT-PCR結果顯示，ONFH股骨頭軟骨中ADAMTS-7的轉錄表達均明顯增加，同時，Western Blot結果顯示隨著股骨頭壞死患者軟骨組織中COMP降解

16、增加。
　　4.免疫組織化學顯示ONFH患者軟骨組織中磷酸化NF-κB P65表達增加，IL-17A可誘導軟骨原代細胞中ADAMTS-7的表達，同時激活NF-κB P65。
　　研究結論:1.股骨頭壞死患者髖關節(jié)液中IL-17A含量增加;
　　2.壞死股骨頭軟骨組織中ADAMTS-7表達增加，并可能通過降解軟骨基質中COMP導致軟骨退變;
　　3.IL-17A可能通過激活NF-κB信號轉導通路誘導軟骨細胞表達AD