人退變椎間盤軟骨終板干細胞的鑒定及性質(zhì)研究.pdf

1、背景：
　　 下腰痛(low back pain，LBP)是當(dāng)今社會中的一種常見疾病。在美國，僅次于上呼吸道感染而居第2位，是導(dǎo)致勞動力喪失的主要原因之一；亞洲國家如中國因為體力勞動者較多，發(fā)病率更高。椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease，DDD)是引起LBP最常見的原因。隨著我國老齡化進程的發(fā)展，DDD越來越成為嚴(yán)重影響人們生活、工作的疾病。
　　 目前治療DDD的方法包括保守治療和手術(shù)

2、治療。保守治療包括物理治療和藥物治療等，手術(shù)治療主要包括髓核摘除術(shù)和脊柱融合術(shù)。手術(shù)治療雖然通過摘除病變的椎間盤組織或者犧牲脊柱局部節(jié)段的活動度來換取癥狀的解除，然而并沒有從根本上解決椎間盤退變所帶來的生物學(xué)功能丟失。近年來的同種異體椎間盤移植和人工椎間盤置換雖然展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，然而與這些技術(shù)相關(guān)的許多并發(fā)癥和缺陷依然需要克服，并且沒有從根本治愈或恢復(fù)椎間盤(intervertebral disk，IVD)生理功能。因此，理想的治

3、療DDD的方法是既能緩解疼痛癥狀，又能恢復(fù)IVD的結(jié)構(gòu)和生理功能。
　　 近年來隨著生物學(xué)治療的迅速發(fā)展，使得外科學(xué)進入“再生修復(fù)”時代。組織工程療法、細胞療法已成為治療DDD的理想方案，為DDD的治療開辟了一條嶄新的生物之路。但是所有這些治療方法都面臨著同樣的問題：植入組織或細胞的營養(yǎng)供應(yīng)。在IVD中，軟骨終板是髓核營養(yǎng)供給的重要結(jié)構(gòu)。為此眾多學(xué)者認為軟骨終板的退變是引起DDD的使動和發(fā)展因素。因此，保持終板組織正常的生理結(jié)構(gòu)

4、和功能、預(yù)防和治療軟骨終板退變才是確保上述療法成功、預(yù)防DDD發(fā)生的關(guān)鍵。軟骨終板中細胞的減少會導(dǎo)致終板退變，因此刺激軟骨終板組織中的原位干細胞增殖、分化并合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)才是解決上述問題的關(guān)鍵。
　　 目的：
　　 本實驗通過獲取人退變椎間盤軟骨終板組織，并消化、分離軟骨終板，提取軟骨終板細胞，分離的軟骨終板細胞經(jīng)過瓊脂糖篩選后進行體外和動物體內(nèi)實驗，證實人退變的軟骨終

5、板組織中存在具有向成軟骨、成骨、成脂方向分化的干細胞。并且通過與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchyme stem cells，BM-MSCs)在形態(tài)、增殖活性、細胞周期、干細胞表面標(biāo)記物和體外多系誘導(dǎo)分化的能力，從而進一步明確退變軟骨終板干細胞(cartilage endplate derived stem cells，CESCs)的特征，為以后生物學(xué)功能的研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 收集

6、因腰椎間盤退變性疾病行腰椎間盤摘除術(shù)并植骨融合的標(biāo)本。在解剖顯微鏡下清理軟骨終板組織，并消化軟骨終板，提取軟骨終板細胞。獲得的軟骨終板細胞經(jīng)過瓊脂糖三維篩選系統(tǒng)培養(yǎng)后，選取細胞克隆團并進行體外擴增，擴增后的細胞行流式細胞術(shù)檢測干細胞標(biāo)志物、克隆形成、多系誘導(dǎo)分化及相關(guān)檢測證實退變軟骨終板中存在干細胞。經(jīng)過瓊脂糖篩選并擴增的細胞同羥基磷灰石復(fù)合后進行動物體內(nèi)誘導(dǎo)實驗，并通過組織染色、免疫組化等技術(shù)明確可以體內(nèi)誘導(dǎo)成骨。為了進一步明確CES

7、Cs的具體性質(zhì)，同來自同一個體的BM-MSCs在細胞增殖能力、干細胞表型、細胞周期、成骨能力、成脂能力、成軟骨能力等方面進行比較，從而進一步明確CESCs的具體性質(zhì)。典型的圖片用來表示定性結(jié)果，應(yīng)用SPSS10.0軟件作統(tǒng)計學(xué)處理，定量結(jié)果采用Student-t進行分析。以P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.共聚焦免疫熒光提示退變椎間盤軟骨終板組織中存在干細胞標(biāo)志物STRO1、CD105、CD73

8、、CD90陽性的細胞。從退變椎間盤軟骨終板中分離出來的細胞進過瓊脂糖篩選培養(yǎng)6周后，可見部分細胞可以形成克隆團，克隆團體外擴增培養(yǎng)后可以貼壁生長、形成細胞克隆、干細胞免疫表型(CD90、CD73、STRO1、CD105)表達為陽性，而CD14，CD19，CD34，CD45和HLA-DR表達量為陰性。體外三系誘導(dǎo)的組織學(xué)和基因鑒定結(jié)果證實分離出來的細胞可以進行成骨、成脂、成軟骨方向誘導(dǎo)分化。軟骨終板干細胞進行成骨和成脂誘導(dǎo)前后逆轉(zhuǎn)錄聚合酶

9、鏈反應(yīng)(reverse transcripdon polymerase chain reaction，RT-PCR)結(jié)果表明問充質(zhì)來源的干細胞標(biāo)志物在誘導(dǎo)后明顯減少，而胚胎干細胞來源的標(biāo)志物在誘導(dǎo)前后無明顯變化，說明軟骨終板來源的干細胞主要是間充質(zhì)性的干細胞，而非胚胎來源的干細胞。
　　 2.體內(nèi)實驗HE染色可見羥基磷灰石的孔隙中含有紅染的均勻的基質(zhì)。甲苯胺藍染色提示具有異染的軟骨基質(zhì)形成。免疫組織化學(xué)結(jié)果證實Ⅰ、Ⅹ型膠原(co

10、llagen typeⅠ、Ⅹ，ColⅠ、ColⅩ)在組織中表達豐富，而Ⅱ型膠原(collagen type，ColⅡ)在組織中表達量較少。
　　 3.CESCs與BM-MSCs在細胞形態(tài)、細胞增殖能力、細胞周期、細胞免疫表型、三系誘導(dǎo)分化中具有相似的性質(zhì)。
　　 4.分離出來的CESCs干細胞表型中CD105、CD166表達量低。在成骨能力上，通過對CESCs和BM-MSCs在礦物結(jié)節(jié)定量分析、堿性磷酸酶活性(alkal

11、ine phosphatase activities，ALP)比較、成骨特異性基因比較的結(jié)果表明CESCs在成骨誘導(dǎo)的早期和晚期具有較強的成骨能力。在成脂能力上，BM-MSCs和CESCs無明顯差異，但是，BM-MSCs成脂誘導(dǎo)過程中具有較大的變異性。在軟骨誘導(dǎo)中，通過比較細胞球濕重、阿利新藍密度、成軟骨特異性基因表達量以及蛋白印跡(western blot，WB)，結(jié)果均表明CESCs具有較強的軟骨形成能力。
　　 結(jié)論：