骨化相關(guān)TWIST基因在椎間盤退變中的作用及機制研究.pdf

1、自從1996年脊柱外科領(lǐng)域權(quán)威雜志《SPINE》上發(fā)表關(guān)于腰痛作為人類世紀難題的文章，腰痛也越來越引起大家的重視，椎間盤變性引起的慢性背痛和頸肩痛是威脅人類健康的嚴重問題，目前沒有有效的治療方法。慢性腰背部疼痛是造成勞動力喪失的常見原因。對于嚴重的椎間盤退行性病變的患者，目前主要采用手術(shù)治療為主的治療方法：腰椎間融合，人工椎間盤置換術(shù)，微創(chuàng)髓核摘除術(shù)等。手術(shù)治療可以一定程度的減輕患者的癥狀，但手術(shù)合并很多并發(fā)癥，例如相鄰節(jié)段椎間盤退變加

2、重，椎間隙感染等，這常常需要進一步的外科手術(shù)。雖然手術(shù)可以減輕臨床癥狀，但既不阻止變性的進展，也不能恢復(fù)椎間盤(Intervertebral disc，IVD)的天然功能狀態(tài)。基于上述外科干擾的情況和限制，因此，在探尋椎間盤退變機制及尋求無創(chuàng)治療的研究一直并未停止。
　　椎間盤退變是復(fù)雜的多因素過程，雖然做了長期大量的研究工作，其確切機制并未完全了解。當前研究以炎癥通路為主，大量研究表明退變的椎間盤細胞能產(chǎn)生炎性介質(zhì)，包括：TNF

3、-α，IL-1α/β，IL-6，IL-10和IFN-γ等等。這些因子導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)促進基質(zhì)降解，趨化因子的產(chǎn)生和細胞表型的改變。由此導(dǎo)致了基質(zhì)成分分解和合成之間出現(xiàn)嚴重不平衡最終導(dǎo)致椎間盤退變。炎癥因子對椎間盤細胞的作用并不存在疾病特異性，具有的局限性，轉(zhuǎn)化效益差等
　　椎間盤是人體中最大的無血管組織。椎間盤由內(nèi)層的富含水和膠原的髓核和外層富含纖維的纖維環(huán)兩部分組成。椎間盤退變的特征在于細胞外基質(zhì)中主要成分Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的含

4、量明顯較少，直接導(dǎo)致與水結(jié)合能力的降低，椎間盤含水量減少，髓核細胞數(shù)量減少，被成纖維細胞樣表型的細胞的替換。椎間盤作為特殊的軟骨組織，其退變過程可能與骨化相關(guān)基因有著密切的聯(lián)系。
　　課題組在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有報道關(guān)于骨化相關(guān)基因RUNX2能夠引起椎間盤退變。TWIST作為骨化相關(guān)基因的重要一員，參與早期抑制RUNX2調(diào)控成骨細胞化?；谏鲜鰞?nèi)容，我們推測在椎間盤退變中，TWIST基因也起著至關(guān)重要的作用。
　　第一部分：

5、TWIST基因在髓核組織中的表達
　　目的：研究TWIST基因在人髓核組織中的表達情況。
　　方法：(1)利用GEO數(shù)據(jù)庫，生物信息學篩選椎間盤退變中骨化相關(guān)基因。(2)收集2016年3月-2017年6月因腰突癥于我院行腰椎手術(shù)的患者的椎間盤標本，根據(jù)磁共振Pfirrmann分級系統(tǒng)，Ⅰ-Ⅱ級為輕度退變對照組，Ⅲ-Ⅴ級為重度退變退變組。共采集患者標本32例，其中對照組12例，退變組20例。對收集的椎間盤組織進行鑒定。(3)對

6、椎間盤組織細胞針對篩選的骨化相關(guān)基因進行免疫組化。(4)椎間盤組織RNA提取及驗證，通過實時定量PCR的檢測方式明確骨化基因在椎間盤退變中的表達。
　　結(jié)果：(1)骨化相關(guān)IBSP、ENPP、OPN等在椎間盤退變網(wǎng)路中存在，提示骨化相關(guān)基因在椎間盤退變中可能具有重要地位。(2)經(jīng)組織學鑒定，椎間盤退變程度與Pfirrmann分級一致，分組合理。（3)組化顯示成骨相關(guān)基因均呈不同程度的上調(diào)，而骨化抑制相關(guān)基因中TWIST1及TWIS

7、T2能夠隨著退變逐漸下調(diào)。(4)通過椎間盤髓核組織的RNA檢測結(jié)果顯示TWIST1及TWIST2確實如組化所示在退變中出現(xiàn)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：我們利用GEO數(shù)據(jù)庫、椎間盤標本免疫組化、椎間盤組織RNA提取與驗證對退變椎間盤中骨化基因進行檢測，明確骨化相關(guān)基因在退變椎間盤中異常表達，TWIST1及TWIST2在退變椎間盤中明顯下調(diào)。
　　第二部分：TWIST基因在人髓核細胞退變過程中的作用
　　目的：研究TWIST基因

8、在人髓核細胞中的表達情況。
　　方法：(1)收集2016年5月-2017年7月因脊柱外傷或脊柱側(cè)彎等患者的Pfirrmann分級Ⅰ-Ⅱ級的椎間盤組織，進行原代人髓核細胞培養(yǎng)。(2)通過TWIST1及2基因全長PCR將TWIST表達CDS區(qū)純化、克隆入表達載體，并于髓核細胞中利用轉(zhuǎn)染試劑進行TWIST1及2基因的過表達，構(gòu)建TWIST的過表達及干擾載體。(3)利用炎癥因子IL-1β與TNF-α進行體外髓核細胞的炎性刺激，構(gòu)建體外髓核

9、細胞退變模型。(4)通過轉(zhuǎn)染TWIST1/TWIST2過表達及干擾載體于髓核細胞中，培養(yǎng)24h后通過Real-time PCR檢測處理后髓核細胞ECM降解相關(guān)MMP、ADAMTS的表達情況明確退變情況。(5)同上處理后通過Western Blot檢測處理后髓核細胞ECM相關(guān)CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表達情況。
　　結(jié)果：(1)通過原代培養(yǎng)髓核組織，成功建立體外髓核細胞系6株。(2)檢測細胞TWIST1及2的表達發(fā)現(xiàn)確實出

10、現(xiàn)上調(diào)，提示過表達及干擾載體構(gòu)建成功。(3)通過檢測發(fā)現(xiàn)刺激后髓核細胞CHSY、ACAN、Ⅱ型膠原等基質(zhì)相關(guān)基因表達減少，基質(zhì)降解相關(guān)MMP、ADAMTS表達顯著增加，體外模型構(gòu)建成功。(4)過表達TWIST1及2基因，髓核細胞CHSY、ACAN、Ⅱ型膠原等基質(zhì)相關(guān)基因表達較對照組顯著增加，基質(zhì)降解相關(guān)MMP、ADAMTS表達顯著減少。
　　結(jié)論：我們通過髓核細胞原代培養(yǎng)、構(gòu)建TWIST過表達載體、構(gòu)建體外退變模型、轉(zhuǎn)染過表達載體

11、等方法，明確TWIST基因在體外確實具有抑制椎間盤退變，保護椎間盤的作用。
　　第三部分：TWIST基因保護椎間盤退變的機制研究
　　目的：研究TWIST基因保護椎間盤退變的機制研究。
　　方法：(1)構(gòu)建RUNX2過表達及干擾載體。(2)于人髓核細胞中過表達RUNX2基因并檢測ECM相關(guān)CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表達情況。(3)利用共轉(zhuǎn)染的方式將TWIST與RUNX2于退變髓核中共表達，檢測ECM相關(guān)CHS

12、Y、MMP、ADAMTS等酶的表達情況。(4)構(gòu)建RUNX2啟動子雙熒光報告載體，檢測TWIST過表達后RUNX2啟動子的活性情況。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建RUNX2過表達及干擾載體。(2)RUNX2過表達后髓核基質(zhì)合成相關(guān)ACAN、COL2A1等基因出現(xiàn)顯著下調(diào)，提示其具有促進退變發(fā)生的作用。(3)共轉(zhuǎn)染TWIST與RUNX2于退變髓核后，RUNX2基因引起的促退變效應(yīng)出現(xiàn)一定程度上的緩解。(4)利用雙熒光素酶報告基因檢測過表