PeroxiredoxionⅡ?qū)w外培養(yǎng)人退變腰椎間盤髓核細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、研究背景：
　　 椎間盤退行性變是導(dǎo)致脊柱解剖結(jié)構(gòu)與功能紊亂性疾患的根本因為。隨著生活節(jié)律與社會老齡化進(jìn)程的加快,與椎間盤退變相關(guān)的脊柱疾病(椎間盤突出癥、退變性椎管狹窄、退變性脊柱滑脫及不穩(wěn)、退變性側(cè)彎等)的發(fā)病率越來越高。雖然國內(nèi)外學(xué)者針對與椎間盤退變有關(guān)因素如金屬基質(zhì)蛋白酶、蛋白多糖酶、彈性蛋白酶、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、自身免疫反應(yīng)、一氧化氮及遺傳因素等進(jìn)行了一系列的研究,對其發(fā)生、發(fā)展有了一定的認(rèn)識,但對退變的根本因為知之

2、甚少。為了深入研究椎間盤退變的病理生理機(jī)制,探討其發(fā)生與發(fā)展的根本因為,我們前期應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,對正常及退變的椎間盤髓核組織進(jìn)行雙向電泳及質(zhì)譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在退變的髓核組織中過氧化物還原酶Ⅱ(Peroxiredoxin Ⅱ,Prx Ⅱ)存在著顯著的差異表達(dá),但該酶在椎間盤退變中的作用及其作用機(jī)理不明。
　　 Prx Ⅱ是過氧化物還原酶Peroxiredoxins(Prxs)家族成員之一,是新近發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量在20～30×1

3、03的蛋白。Prxs的功能多樣,具有抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與細(xì)胞周期進(jìn)程和發(fā)揮分子伴侶等功能。抗氧化作用是其最主要的功能,H2O2是Prxs主要反應(yīng)底物之一,細(xì)胞利用Prxs清除有害的H2O2以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞免受損傷的目的。然而近年來H2O2作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使越來越受到重視,因而作為H2O2重要調(diào)節(jié)物的Prxs亦成為研究熱點(diǎn),雖然既往的大多研究都著重于Prxs對細(xì)胞的保護(hù)作用,參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、抗氧化等。但近年來一些

4、研究發(fā)現(xiàn)其功能不僅僅局限于此。髓核細(xì)胞作為生物體中的一種特殊類型的細(xì)胞,在退變的髓核中發(fā)現(xiàn)PrxⅡ,到底PrxⅡ發(fā)揮何種作用?在椎間盤退變中扮演何種角色呢?文章旨在通過體外培養(yǎng)椎間盤髓核細(xì)胞,于細(xì)胞中加入Prx Ⅱ,觀察其對退變的髓核細(xì)胞的影響,探討其在椎間盤退變中的作用。
　　 目的：
　　 通過體外培養(yǎng)原代及傳代退變椎間盤髓核細(xì)胞,在傳二代髓核細(xì)胞中加入不同濃度的過氧化物酶Ⅱ,倒置顯微鏡下觀察髓核細(xì)胞形態(tài)變化,cck

5、-8試劑盒檢測細(xì)胞活性變化,用夾心抗體ELISA檢測Ⅱ型膠原合成的改變,探討PrxⅡ在椎間盤退變過程中的作用。
　　 方法
　　 本試驗分三部分進(jìn)行,第一:髓核組織的獲得,原代髓核細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及傳代。第二部分:試驗用傳二代細(xì)胞,設(shè)立對照組及實驗組,對照組為不加Prx-Ⅱ,實驗組中分別加入不同濃度的Prx-Ⅱ(10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL),于1、3、5、7天觀察各組中細(xì)胞形態(tài)變化、cck-8試

6、劑盒檢測細(xì)胞活性；第三部分:試驗用傳二代細(xì)胞,設(shè)立對照組及實驗組,對照組為不加Prx-Ⅱ,實驗組中加入不同濃度Prx-Ⅱ(10ng/mL、100ng/mL、1000 ng/mL)后于3、7天取對照組及實驗組上清,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定Ⅱ型膠原表達(dá)情況。
　　 結(jié)果
　　 1、在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察,原代髓核細(xì)胞于6-7天貼壁,細(xì)胞多為梭形,有偽足伸出；經(jīng)胰酶消化傳代后,細(xì)胞貼壁生長速度加快,于7

7、天后達(dá)到生長高峰,以后細(xì)胞生長減緩。細(xì)胞傳至第4代后細(xì)胞明顯萎縮,凋亡增加。而加入PrxⅡ組椎間盤細(xì)胞生長減緩,生長周期縮短。2、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色胞質(zhì)及核內(nèi)呈現(xiàn)黃染的顆粒狀陽性結(jié)果,證實為髓核細(xì)胞,實驗組較對照組染色明顯變淺。3、cck-8法測定椎間盤髓核細(xì)胞吸光度(OD)值經(jīng)過析因方差分析檢驗F=213.780,P=0.000,說明五組之間比較差異具有顯著性。相同時間點(diǎn)不同組之間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；

8、同一組之間不同時間點(diǎn)之間比較差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4、采用雙抗體ELSA試驗測得第3天及第7天Ⅱ型膠原蛋白OD值,經(jīng)計算得出Ⅱ型膠原蛋白的濃度,采用析因方差分析得出F=126.340,P=0.000。說明實驗組與對照組之間有顯著性差異((P<0.05)；采用單因素方差分析得出:第7天不同組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),第3天,對照組與實驗組之間有差異,但10ng/ml組與100ng/ml組間比較差異無

9、顯統(tǒng)計學(xué)意義,可能操作等因誤差引起；同一組之間不同時間點(diǎn)之間用t檢驗差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明隨著時間的延長,細(xì)胞凋亡加重。PrxⅡ能降低細(xì)胞的增殖活性,細(xì)胞基質(zhì)的合成,并且在有一定濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 本實驗為椎間盤髓核細(xì)胞的培養(yǎng)提供了簡單、有效的方法,體外培養(yǎng)的人退變腰椎間盤髓核細(xì)胞,加入過氧化物酶后,椎間盤髓核細(xì)胞數(shù)量減少,活力降低,髓核細(xì)胞合成Ⅱ型膠原的量減少,且隨著PrxⅡ