轉(zhuǎn)基因CTGF和TIMP1髓核細胞移植阻逆兔腰椎間盤退變的實驗研究.pdf

1、[目的]椎間盤退變是引起腰背痛的主要原因，尋找延緩或阻逆椎間盤退變的有效方法被認為是非常有意義的嘗試。為此，我們在微創(chuàng)CT引導穿刺建立兔椎間盤退變模型的基礎上，將腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)介導的結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissueinhibitor of metalloproteinases1，TI

2、MP1)雙基因體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染兔椎間盤髓核細胞后，再將轉(zhuǎn)基因細胞移植于退變兔腰椎間盤內(nèi)，不同時期分別觀察椎間盤信號、椎間高度、Ⅱ型膠原和蛋白多糖合成的變化，以探討體外延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤細胞退變的方法。
　　 [方法]63只新西蘭大白兔為實驗用兔，其中60只應用CT引導下的微創(chuàng)穿刺法建立兔椎間盤退變模型：選擇L2-3、L3-4、L4-5椎間盤層面進行CT掃描以穿刺，L1-2、L5-6椎間盤不穿刺作為對照組。以左后方為進針點，測量穿刺角度

3、及深度。消毒后在CT定位下，經(jīng)皮以18G的穿刺針由右后方穿刺腰椎間盤。穿刺針尖接近纖維環(huán)時行CT掃描，調(diào)整穿刺角度。刺入髓核腔后再次CT掃描，確定針尖位于髓核中央。造模2周后行MRI掃描以檢查椎間盤退變狀況。另外3只細胞培養(yǎng)時取椎間盤用。rAAV2-CTGF-TIMP1按每個細胞10-6個病毒顆粒與適量的無血清HAMF12/DMEM細胞培養(yǎng)液混合，將上述混合液加入PBS緩沖液洗過的二代髓核細胞中以轉(zhuǎn)染細胞。采用上述微創(chuàng)穿刺法，選取L2-

4、3、L3-4、L4-5退變椎間盤，以32G穿刺針穿入髓核內(nèi)，將22μ l的轉(zhuǎn)基因細胞懸液緩緩注射于椎間盤內(nèi)作為細胞移植組；退變椎間盤內(nèi)注入磷酸鹽緩沖液(。PBS)作為退變對照組；正常椎間盤作為空白對照組。
　　 分別于6、10、14周行X線觀察椎間高度的變化、測定并比較％DHI；行MRI檢查以觀查椎間盤信號的改變；HE染色、Safranine0染色及Masson染色觀察轉(zhuǎn)基因前后椎間盤組織變化；免疫組化染色觀察髓核細胞Ⅱ型膠原的

5、表達；Western-blot鑒定細胞因子CTGF和TIMP1在椎間盤內(nèi)的表達；35S整合法測定兔髓核組織蛋白多糖合成率；RT-PCR檢測Ⅱ型膠原及蛋白多糖mRNA的表達。采用統(tǒng)計學軟件SPSS15.0進行方差分析和多樣本均數(shù)兩兩比較。P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]CT引導下經(jīng)皮微創(chuàng)穿刺法具有創(chuàng)傷小、操作安全等優(yōu)點，MRI證實穿刺2周后椎間盤開始退變，該方法為建立兔椎盤退變模型新的有效方法。腺相關病毒(AAV)

6、可高效轉(zhuǎn)染兔髓核細胞并快速介導目的基因的表達。X線檢查示6，10，14周后退變對照組％DHI明顯低于細胞移植組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示細胞移植組椎間高度較對照組得以維持。MRI證實，隨著觀察時間的延長，退變對照組椎間盤退變呈進行性加重。在6、10周、14周，依據(jù)改良Thompson法分級，轉(zhuǎn)基因細胞移植組和退變對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HE染色示轉(zhuǎn)基因細胞移植后髓核內(nèi)細胞較多，分部較均勻：Safrani

7、ne0染色證實轉(zhuǎn)基因后髓核細胞蛋白多糖表達明顯增多；Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細胞移植后，椎間盤的退變延緩明顯。Ⅱ型膠原免疫組化染色結果示轉(zhuǎn)基因后兔髓核細胞合成分泌Ⅱ型膠原能力較前有所增加，細胞移植組和退變對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)基因細胞移植后Western-Blot檢測6周、10周及14周時細胞因子在椎間盤內(nèi)的表達結果顯示：CTGF均有陽性表達，而TIMP1在6周及10周時有陽性表達，在14周時表達則明顯減

8、弱，提示CTGF在體內(nèi)椎間盤的表達更具有持久性。轉(zhuǎn)基因細胞移植后第6周，10周及14周，應用RT-PCR檢測檢測蛋白聚糖和Ⅱ型膠原mRNA的表達，細胞移植組和退變對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白對照組和和退變對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，細胞移植組和空白對照組相比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)基因細胞移植后第6周，10周及14周，應用5S整合法檢測檢測蛋白多糖的合成率，細胞移植組和空白對照組分別

9、與退變對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，細胞移植組和空白對照組相比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 [結論]微創(chuàng)經(jīng)皮CT引導下穿刺椎間盤可成功建立兔椎間盤退變模型。腺相關病毒介導的CTGF和TIMP1可以在兔髓核細胞內(nèi)成功表達。體外轉(zhuǎn)雙基因CTGF和TIMP1髓核細胞再行體內(nèi)移植后，可有助于椎間高度的維持，促進椎間盤正常MRI信號的恢復。免疫組化、RT-PCR及5S整合法均證實轉(zhuǎn)雙基因細胞移植可明顯促進退變