腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的CTGF和TIMP-,1-雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染恒河猴腰椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)介導(dǎo)的結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissueinhibitor of metalloproteinases 1，TIMP1)單基因及雙基因體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染恒河猴椎問盤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，并觀察雙基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染退變的恒河猴腰椎問盤的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：體外實(shí)驗(yàn)：通過酶

2、消化法培養(yǎng)恒河猴腰椎間盤髓核細(xì)胞，以不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的rAAV2-EGFP(enhanced green fluorescent protein，EGFP)轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，確定最佳的感染復(fù)數(shù)。以最佳感染復(fù)數(shù)的rAAV2-CTGF、rAAV2-TIMP1及rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1病毒質(zhì)粒分別感染髓核細(xì)胞，用Westernblot鑒定細(xì)胞因子的表達(dá)，通過RT-PCR、

3、35S及番紅。染色觀察CTGF、TIMP1及雙基因聯(lián)合感染髓核細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺纖維環(huán)誘導(dǎo)恒河猴腰椎間盤退變，微創(chuàng)經(jīng)皮注入雙基因病毒質(zhì)粒，應(yīng)用RT-PCR、Westemblot鑒定細(xì)胞因子的表達(dá)，RT-PCR、35S及組織學(xué)染色觀察雙基因聯(lián)合感染對退變椎間盤的生物學(xué)作用。 結(jié)果：體外部分：通過rAAV2-EGFP轉(zhuǎn)染猴腰椎間盤髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MOI為106時(shí)，轉(zhuǎn)染效率較高。rAAV2-CTGF、r

4、AAV2-TIMP1及rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1雙基因能夠轉(zhuǎn)染恒河猴椎間盤髓核細(xì)胞，并在其內(nèi)表達(dá)細(xì)胞因子。與對照組相比，CTGF可以促進(jìn)Ⅱ型膠原及蛋白多糖的合成，TIMP1可以促進(jìn)蛋白多糖的合成，對Ⅱ型膠原的合成未見到明顯作用。雙基因聯(lián)合感染可以促進(jìn)髓核細(xì)胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，其效果優(yōu)于單基因。體內(nèi)部分：經(jīng)皮穿刺纖維環(huán)的方法可以建立椎問盤退變的早期模型，rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1雙基因可以在體內(nèi)長期