白介素-1β對(duì)退變椎間盤髓核細(xì)胞凋亡和分解代謝的影響及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、腰痛（low back pain，LBP）是導(dǎo)致現(xiàn)代人活動(dòng)功能障礙，影響生活質(zhì)量的常見原因，現(xiàn)階段臨床尚缺乏有效的治療手段。椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IVD）被認(rèn)為是導(dǎo)致腰痛的重要原因，但其確切發(fā)病機(jī)制并不清楚。既往研究表明炎癥因子與椎間盤退變誘導(dǎo)的盤源性腰痛密切相關(guān)，白介素-1β（interleukin-1 beta,IL-1β）是其中研究較為廣泛的一個(gè)因子。但I(xiàn)L-1β對(duì)人退變髓核

2、細(xì)胞（nucleus pulposus cells,NPCs）凋亡和分解代謝的影響及其調(diào)控機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。本課題擬從IL-1β通過線粒體途徑誘導(dǎo)NPCs凋亡；IL-1β介導(dǎo)的線粒體損傷激活了NPCs自噬；自噬抑制IL-1β誘導(dǎo)的NPCs凋亡；SIRT1通過TLR2/NF-κB信號(hào)通路抑制IL-1β對(duì)胞外基質(zhì)的分解作用四個(gè)方面分別進(jìn)行闡述。
　　第一部分、IL-1β通過線粒體途徑誘導(dǎo)NPCs凋亡
　　目的：探討IL-1β是

3、否通過線粒體途徑介導(dǎo)退變NPCs凋亡。
　　方法：將來自于正常和退變組的髓核組織，采用western blot、免疫組化和TUNEL染色分別原位比較IL-1β表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況。采用酶序貫消化法分離、培養(yǎng)退變組的髓核細(xì)胞。以不同濃度IL-1β作用后，AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖以此篩選最佳作用濃度。分別采用大體形態(tài)觀察、Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清存在與否對(duì)IL-1β誘導(dǎo)

4、NPCs凋亡是否存在影響。Western blot檢測(cè)線粒體凋亡通路關(guān)鍵蛋白Bax、Bcl-2和細(xì)胞色素C；DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量；酶標(biāo)儀測(cè)定線粒體凋亡通路最后執(zhí)行蛋白caspase-3和caspase-9酶活性。
　　結(jié)果：退變髓核組織中IL-1β表達(dá)和細(xì)胞凋亡數(shù)均要顯著高于正常組（P＜0.05），提示IL-1β高表達(dá)與退變髓核中細(xì)胞凋亡增高存在聯(lián)系。篩選出10ng/ml濃度IL-1β為最佳亞致死劑量。在血

5、清剝奪條件下，IL-1β可以明顯誘導(dǎo)NPCs凋亡（P＜0.05），但正常培養(yǎng)條件下血清可以中和IL-1β的細(xì)胞毒性作用。IL-1β可以明顯誘導(dǎo) Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比增高（P＜0.05），以及促進(jìn)Cyt C從線粒體釋放入胞質(zhì)中，提示線粒體凋亡通路被激活；ROS和caspase酶活性檢測(cè)進(jìn)一步表明，IL-β作用可以明顯提高NPCs內(nèi)ROS表達(dá)（P＜0.05），以及顯著提高caspase-3和caspase-9酶活性（P＜0.05）。

6、
　　結(jié)論：IL-1β在無血清條件下，可以通過線粒體途徑明顯誘導(dǎo)退變NPCs凋亡。
　　第二部分、IL-1β介導(dǎo)的線粒體損傷激活了NPCs自噬
　　目的：探討IL-1β對(duì)NPCs的線粒體是否具有直接損傷作用，損傷的線粒體能否進(jìn)一步激活自噬。
　　方法：以10%FBS正常培養(yǎng)組作為對(duì)照，在血清剝奪條件下加或不加10ng/ml IL-1β刺激，采用JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位，ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP合成量，

7、透射電鏡直接觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，直接判斷IL-1β對(duì)線粒體損傷的作用。另一方面，Western blot測(cè)定自噬相關(guān)蛋白LC3和P62；為了更加直接觀察IL-1β對(duì)自噬的影響，采用含GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染NPCs，觀察綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)，以此判斷自噬激活器情況；為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL-1β對(duì)自噬的激活作用是因?yàn)榧せ盍恕白允闪鳌边€是阻礙了自噬的降解，采用自噬的抑制劑0.1μmol/L Bafilomycin A1（BAF）預(yù)處理2h再檢測(cè)LC3

8、和P62的表達(dá)；最后采用經(jīng)典透射電鏡觀察自噬體判斷在IL-1β作用下NPCs內(nèi)自噬的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：在血清剝奪條件下可以導(dǎo)致線粒體膜電位適度下降，但一旦加入IL-1β作用，膜電位則進(jìn)一步顯著降低（P＜0.05）；雖然0%FBS培養(yǎng)條件下ATP合成量與對(duì)照組無明顯差別（P＞0.05），但I(xiàn)L-1β顯著降低了ATP合成（P＜0.05）；電鏡觀察結(jié)果顯示0%FBS組線粒體形態(tài)發(fā)生腫脹或空泡樣變性；而在IL-1β炎性刺激下，線粒體形

9、態(tài)進(jìn)一步改變，發(fā)生基質(zhì)固縮，線粒體內(nèi)嵴斷裂，外膜完整性消失。上述結(jié)果提示IL-1β可以明顯誘導(dǎo)線粒體發(fā)生損傷。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，IL-1β作用下顯著提高了LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)比，而降低了P62表達(dá)，提示IL-1β可以激活退變NPCs內(nèi)細(xì)胞自噬。GFP-LC3激光共聚焦結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，IL-1β處理后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著增多。接著采用BAF處理后，western blot結(jié)果顯示LC3-II/LC3-I表達(dá)比和P62蛋白

10、表達(dá)均顯著上升（P＜0.05），由此證明IL-1β激活了NPCs自噬流爆發(fā)，而非阻礙了自噬的降解。透射電鏡直接觀察結(jié)果表明0%FBS＋I(xiàn)L-1β組觀察到不僅自噬體數(shù)量增多，還可以在個(gè)別自噬-溶酶體內(nèi)觀察到尚未被完全消化的線粒體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證明了IL-1β介導(dǎo)的自噬具有清除損傷線粒體的作用。
　　結(jié)論：IL-1β介導(dǎo)了退變NPCs線粒體損傷，并進(jìn)一步激活了自噬。
　　第三部分、自噬抑制IL-1β誘導(dǎo)的NPCs凋亡
　　目

11、的：探討IL-1β所激活的自噬對(duì)NPCs凋亡影響。
　　方法：采用自噬的特異性抑制劑3-MA（5mmol/L）預(yù)處理NPCs后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，JC-1染色檢測(cè)對(duì)線粒體膜電位影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證 IL-1β所激活的自噬是否為代償性的線粒體自噬（mitophagy），western blot分別檢測(cè)了mitophagy的關(guān)鍵誘導(dǎo)蛋白Parklin的線粒體和胞質(zhì)表達(dá)。采用自噬激動(dòng)劑RAP（50nmol/L）預(yù)處理后，同時(shí)轉(zhuǎn)染A

12、d-GFP-LC3和Ad-HBmTur-Mito腺病毒，其中GFP-LC3標(biāo)記自噬體，而HBmTur-Mito標(biāo)記線粒體，轉(zhuǎn)染后通過激光共聚焦觀察共定位情況，以此判斷是否發(fā)生了線粒體自噬。
　　結(jié)果：3-MA抑制NPCs中自噬活性后，細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.05），線粒體膜電位則進(jìn)一步降低（P＜0.05），說明自噬被抑制后，NPCs線粒體功能受到了進(jìn)一步破壞。加入IL-1β刺激后發(fā)現(xiàn)Parkin在線粒體上的表達(dá)明顯上升（P＜0.

13、05），而在胞質(zhì)中的表達(dá)明顯下降（P＜0.05），說明其發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)位，提示誘導(dǎo)了mitophagy。而加入自噬激動(dòng)劑RAP后，黃色熒光斑點(diǎn)進(jìn)一步增多，證明IL-1β所激活的自噬與線粒體自噬有關(guān)。
　　結(jié)論：IL-1β介導(dǎo)的自噬激活，具有代償性保護(hù)NPCs凋亡作用，部分參與了線粒體自噬地發(fā)生。
　　第四部分、SIRT1通過TLR2/NF-κB信號(hào)通路抑制IL-1β對(duì)胞外基質(zhì)分解作用
　　目的：探討在IL-1β促分解作

14、用下，SIRT1對(duì)ECM的調(diào)控作用及其潛在機(jī)制。
　　方法：將來自于正常和退變組的髓核組織，采用免疫組化檢測(cè)SIRT1、MMP-3和MMP-13原位表達(dá)，western blot檢測(cè)各個(gè)髓核組織中SIRT1、II型膠原和aggrecan蛋白表達(dá)差異。采用SIRT1過表達(dá)慢病毒和SIRT1-siRNA慢病毒靶向調(diào)控NPCs中SIRT1表達(dá)，探討對(duì)ECM的表達(dá)調(diào)控作用。采用western blot、免疫共沉淀和細(xì)胞免疫熒光進(jìn)一步探討S

15、IRT1是否通過TLR2/NF-κB信號(hào)通路參與了ECM表達(dá)調(diào)控。
　　結(jié)果：組織的免疫組化和western blot結(jié)果顯示SIRT1在退變髓核髓核中表達(dá)明顯下降，而基質(zhì)降解酶MMP-3和MMP-13表達(dá)明顯升高，伴隨著ECM主要成分COL2A1和aggrecan表達(dá)降低。這一結(jié)果提示SIRT1與ECM表達(dá)之間存在密切聯(lián)系。采用慢病毒靶向調(diào)控SIRT1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，SIRT1過表達(dá)可以明顯抑制IL-1β對(duì)COL2A1和aggrec

16、an地降解作用，而沉默SIRT1表達(dá)可以明顯增加MMP-3和MMP-13表達(dá)。提示SIRT1能夠抑制IL-1β對(duì)ECM降解作用。進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在加入IL-1β刺激后，TLR2-NF-κB通路被激活，免疫共沉淀顯示SIRT1與P65之間存在相互作用關(guān)系，SIRT1過表達(dá)后，TLR2以及P65的總蛋白、乙?；鞍妆磉_(dá)均降低。此外，當(dāng)P65表達(dá)降低后，MMP-3和MMP-13的表達(dá)也隨之降低。免疫熒光顯示IL-1β所誘導(dǎo)的 P65