白介素-15對膿毒癥大鼠骨骼肌蛋白分解代謝的影響.pdf

1、研究背景:
　　 膿毒癥是嚴重創(chuàng)(燒)傷、休克、外科大手術后常見的并發(fā)癥，來勢兇險，病情演變很快，常并發(fā)多器官功能障礙綜合癥(MODS)，有極高病死率。負氮平衡為膿毒癥狀態(tài)機體代謝的典型特征，占機體細胞干重50％的骨骼肌蛋白的高分解代謝是其主要原因之一。
　　 膿毒癥狀態(tài)下骨胳肌蛋白高分解代謝涉及一個錯綜復雜的代謝調控網絡。泛素系統(tǒng)是近年來新發(fā)現的一種蛋白降解途徑，在機體代謝調節(jié)中起重要作用。研究認為膿毒癥大鼠骨骼肌蛋白

2、高分解代謝與泛素-蛋白酶系統(tǒng)密切相關。膿毒癥時機體釋放多種因子(生長因子，白介素家族因子，腫瘤壞死因子等)，能直接或間接誘導泛素系統(tǒng)激活，影響骨骼肌蛋白降解率。白介素-15(IL-15)具有廣泛的生物學活性，在骨骼肌中高表達。研究表明IL-15能夠明顯逆轉腫瘤惡病質小鼠模型骨骼肌重量下降趨勢，并能夠下調泛素(Ub)活性，影響蛋白質降解。目前關于IL-15對膿毒癥狀態(tài)下骨骼肌蛋白質分解代謝影響的研究罕見，機制尚不清楚。研究認為TNF-α能

3、夠明顯增強泛素系統(tǒng)的表達及活性，促進骨骼肌蛋白降解。相關研究也提示IL-15和TNF-α的釋放與活性存在著相互作用，IL-15對泛素-蛋白酶途徑的影響可能由TNFα介導，也可能是由IL-15直接作用于泛素-蛋白酶途徑，其具體作用機制有待進一步明確。
　　 研究目的:
　　 基于以上研究結果，本課題試圖通過動物實驗，擬進一步描述、探討膿毒癥狀態(tài)下機體骨骼肌蛋白降解規(guī)律、IL-15、泛素系統(tǒng)蛋白及基因的表達水平變化情況和互相

4、作用機制。摸索外源性IL-15干預的最佳時間點及劑量。提出假設：外源性IL-15干預能下調機體膿毒癥骨骼肌蛋白質降解率，為膿毒癥高代謝惡病質的防治探索新的途徑。
　　 實驗方法:
　　 1.用盲腸結扎穿孔法(CLP)建立穩(wěn)定的膿毒癥大鼠模型：CLP術后觀察大鼠一般生命體征參數，各臟器損傷程度，觀察模型是否建立穩(wěn)定。
　　 2.健康SD大鼠隨機分為CLP組(A組)、假手術對照組(B組)。于觀察時間點(2h、4h、8

5、h、12h、24h)活殺大鼠離體孵育伸趾長肌，高效液相質譜法測定總蛋白(Tyr)和肌纖維蛋白(3-MH)降解率；取血液、骨骼肌和臟器，用酶聯免疫吸附法(ELISA)、組織芯片免疫組織化學染色法(IH)和實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析Ub和IL-15的基因和蛋白表達變化規(guī)律。
　　 3.外源性IL-15干預的時間及劑量摸索：根據前期研究結果，選擇CLP術后8小時為時間效應點。CLP術后6h(C組)、7.5h(

6、D組)、8h(E組)外源性IL-15干預組于干預時間點大鼠尾靜脈注射高純度重組鼠IL-15(100μg/Kg)，其余時間點及非干預組(F組)注射相同劑量生理鹽水。于12h活殺取標本，分析指標變化。求IL-15干預的最佳時間點(T0)。
　　 4.外源性IL-15干預：膿毒癥大鼠(CLP術后)分為2組，對照組(G組)在T0(CLP術后Th)尾靜脈注射生理鹽水；干預組(H組)大鼠在T0尾靜脈注射高純度重組IL-15，劑量為M0，分析

7、指標差異。
　　 5.TNFα單克隆抗體干預：對照組(I組)單純給予外源性IL-15干預，于CLP后2h及8h予以生理鹽水注射。外源性IL-15+TNFα單抗干預組(J組)：在CLP后7h尾靜脈注射重組IL-15同時，于CLP后2h及8h，分兩次尾靜脈注射TNFα單抗(3mg/kg)。分析指標差異。
　　 實驗結果及討論：
　　 1.采用盲腸結扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥大鼠模型。術后隨時間延長，CLP組大鼠一般

8、狀態(tài)惡化，血漿中內毒素水平進行性增高。對照組參數穩(wěn)定。兩組比較差異顯著(P＜0.01)。病理光鏡顯示CLP術后大鼠肝臟、腎臟細胞壞死、核裂解，骨骼肌細胞斷裂。
　　 2.A組膿毒癥大鼠CLP術后血漿、組織內IL-15和泛素的蛋白及m RNA總體表達水平高于B組(P＜0.01)，均先升高后期有所下降。較之B組，A組大鼠CLP術后血清IL-15蛋白于術后8h達最高峰后下降；骨骼肌中IL-15和Ub m RNA水平于術后4h增高，12

9、h至高峰；骨骼肌蛋白代謝率隨時間延長進行性增高(P＜0.01)，24h達最高峰。推斷CLP術后8h為有效代償時間窗，確定為時間效應點。
　　 3.摸索性外源性IL-15干預實驗中，較F組，C組、D組、E組大鼠骨骼肌代謝率降低，血清IL-15濃度升高，血清Ub濃度降低(P＜0.01)，推斷最佳干預時間點(T0)為CLP后7h。骨骼肌肌纖維蛋白代謝率與血清IL-15濃度呈負相關(r=-0.41374，P＜0.05)，與Ub濃度呈正相

10、關(r=0.76247，P＜0.01)。
　　 4.外源性重組IL-15細胞因子干預實驗中，較G組，H組蛋白代謝率明顯降低(P＜0.01)，H組血漿、組織中IL-15蛋白表達升高(P＜0.05)。說明IL-15能有效拮抗骨骼肌蛋白的降解效應。
　　 5.兩組血漿組織中IL-15和Ub表達水平差異有顯著性(P＜0.01)，I組骨骼肌肌纖維蛋白代謝率較J組低(P＜0.01)，但是骨骼肌總蛋白代謝率無統(tǒng)計學差異。說明IL-15

11、對泛素-蛋白酶途徑的影響可能由TNF-α介導，但不是唯一通路。提示骨骼肌細胞存在IL-15特異受體。
　　 小結:
　　 本研究建立了穩(wěn)定的①膿毒癥大鼠模型；②體外骨骼肌有氧孵育系統(tǒng)；③高效液相-質譜法檢測三甲基組氨酸和酪氨酸的方法；④分析IL-15和泛素系統(tǒng)基因和蛋白表達的方法與條件。
　　 實驗結果描述了膿毒癥病理狀態(tài)下，機體IL-15和泛素基因、蛋白水平的表達規(guī)律，觀察到膿毒癥時IL-15和Ub的表達與骨骼

12、肌的代謝率相關。病理狀態(tài)下IL-15的轉錄翻譯被激活。通過外源性重組IL-15因子的干預，初步摸索了IL-15干預的時間點(CLP后7h)和劑量(100μg/Kg)。實驗顯示IL-15干預能降低膿毒癥骨骼肌蛋白代謝率，推測CLP后7h為最佳干預時間點。通過TNF-a阻斷劑干預，認為IL-15對Ub系統(tǒng)的影響可能由TNF-α介導，但不是唯一通路。在危重病狀態(tài)下，內源性IL-15的合成遠不能滿足機體的消耗，刺激合成以及外源性的補充十分必要。