重水標(biāo)記法測定日糧賴氨酸攝入量對大鼠骨骼肌蛋白代謝動力學(xué)的影響.pdf

1、目的:
　　給予大鼠一定濃度的2H2O作為示蹤劑標(biāo)記動物體內(nèi)骨骼肌蛋白，以期建立氘標(biāo)記丙氨酸的檢測方法，為研究骨骼肌蛋白分?jǐn)?shù)代謝率提供方法保證;在日常飲食狀態(tài)下，分別觀察大鼠在較長時間內(nèi)攝入含有低(0.2％)、正常(0.9％)、高(1.6％)劑量的賴氨酸飼料，骨骼肌蛋白分?jǐn)?shù)合成率是否相同，分析骨骼肌蛋白代謝動力學(xué)指標(biāo)是否對賴氨酸攝入量敏感，骨骼肌蛋白代謝動力學(xué)是否一致。分析2H2O標(biāo)記法是否能有效測定骨骼肌蛋白的合成動力學(xué)參數(shù)，是

2、否適用于長期標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，從而為進(jìn)一步進(jìn)行人體賴氨酸動力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分:(1)2H2O標(biāo)記大鼠身體水90min，收集血液;2H2O標(biāo)記大鼠骨骼肌一周，收集四肢肌肉，提取骨骼肌蛋白和血漿游離氨基酸。將身體水中的2H與丙酮發(fā)生交換，萃取丙酮。(2)酸水解法水解骨骼肌蛋白，收集水解后丙氨酸，同時收集血液游離丙氨酸。(3)對骨骼肌水解后丙氨酸經(jīng)0.22μm微孔膜對水解液進(jìn)行過濾，對血漿游離丙氨酸進(jìn)行分離和

3、純化。(4)對丙氨酸進(jìn)行衍生化處理，身體水的萃取物經(jīng)過微孔膜過濾，分別經(jīng)GC/MS檢測，確定了氘標(biāo)記丙氨酸檢測方法的可行性。第二部分:(1)參考AIN-93G各氨基酸成分比例設(shè)計三種飼料賴氨酸含量分別為低(0.2％)、正常(0.9％)、高(1.6％)。(2)健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，12周齡，體重320g左右，隨機(jī)分為3組，每組24只。分別給予低、正常和高劑量賴氨酸飼料，喂養(yǎng)8周，自由進(jìn)食，正常飲水。(

4、3)自第9周開始，給予大鼠2H2O以標(biāo)記血液游離丙氨酸、骨骼肌蛋白以及身體水，標(biāo)記至第18周結(jié)束。18周內(nèi)每周稱量大鼠體重并記錄每組大鼠的進(jìn)食量。(4)在8，9，11，13，14，18周處死大鼠，收集血液和四肢肌肉，作為樣本，用凱氏定氮法測骨骼肌蛋白的含量，GC/MS檢測骨骼肌蛋白中的2H-丙氨酸的豐度、血漿游離丙氨酸中2H的豐度及身體水的2H豐度，觀察各豐度的變化情況。(5)分別繪制各組大鼠骨骼肌蛋白中2H示蹤劑的變化趨勢圖，計算2H

5、標(biāo)記骨骼肌蛋白的代謝動力學(xué)方程和蛋白質(zhì)的合成率，比較不同日糧賴氨酸組所得結(jié)果的異同，觀察身體水的2H豐度的變化情況，分析不同賴氨酸攝入水平對機(jī)體骨骼肌蛋白代謝動力學(xué)具有怎樣的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分:(1)腹腔注射2H2O90min后，身體水中丙酮的分子量為58/59，血漿游離丙氨酸衍生物的分子量為99/100、158/159基團(tuán)的豐度均可測出，確定了身體水中2H豐度出峰時間為2.3min左右。(2)大鼠骨骼肌蛋白中

6、丙氨酸衍生物的分子量為99/100、158/159基團(tuán)的豐度均可測出，通過與標(biāo)準(zhǔn)庫對比，確定骨骼肌丙氨酸衍生物的出峰時間為8.45min左右，且結(jié)果具有一致性。第二部分:(1)大鼠飼料的檢測結(jié)果，低、正常和高劑量飼料中賴氨酸含量分別為0.23g/100g、0.89 g/100g和1.61 g/100g，均符合實(shí)驗(yàn)要求。(2)三組大鼠的日均進(jìn)食量分別為21.64g、23.07g和23.78g，低劑量賴氨酸組大鼠的進(jìn)食量明顯減少，而正常劑量

7、組與高劑量賴氨酸組大鼠的進(jìn)食量并未受到顯著影響。(3)高劑量賴氨酸組與正常劑量組大鼠體重均值分別是低劑量組大鼠體重均值的1.20倍和1.17倍，三組大鼠體重均值具有顯著性差異，隨賴氨酸攝入量增高，體重呈增加趨勢。(4)低、正常和高劑量組大鼠身體水中2H豐度均值分別為:0.1116、0.1190和0.1180，大鼠身體水被氘標(biāo)記，攝入2H2O后2H能夠在很短時間內(nèi)與全身各組織的水達(dá)到平衡并且穩(wěn)定。(5)三組大鼠的骨骼肌蛋白含量分別為18.

8、28％、18.87％和18.77％，無顯著性差別。（6）低、正常和高劑量賴氨酸組的骨骼肌蛋白分?jǐn)?shù)合成率分別為11.6％，12.8％和18.8％。(7)骨骼肌蛋白合成動力學(xué)方程為:低劑量賴氨酸組ft=0.1604×(1-e-0116t);正常劑量賴氨酸組ft=0.158×(1-e-0128t);高劑量賴氨酸組ft=0.1464×(1-e-01878t)。
　　結(jié)論:
　　腹腔注射2H2O90min后，即能檢測出血漿游丙氨酸和身

9、體水被氘標(biāo)記，說明攝入2H2O后能夠成功的標(biāo)記血漿游丙氨酸并且2H能在很短時間內(nèi)與全身各組織的水達(dá)到平衡;每日給予4％2H2O作為日常飲水，持續(xù)1周后，即能檢測出骨骼肌蛋白中的丙氨酸被氘標(biāo)記，說明該方法能夠成功標(biāo)記骨骼肌蛋白。與正常劑量賴氨酸(0.9％)攝入量組大鼠骨骼肌蛋白分?jǐn)?shù)合成率相比，低劑量賴氨酸(0.2％)攝入量組大鼠骨骼肌蛋白分?jǐn)?shù)合成率略有降低，高劑量賴氨酸(1.6％)掇入量組提高了大鼠骨骼肌蛋白的分?jǐn)?shù)合成率。從骨骼肌蛋白分?jǐn)?shù)