抗VWF-A3區(qū)特異性單抗SZ-123單鏈抗體的制備和生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究背景：
　　 血栓性疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，血栓形成機(jī)制的研究是醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域重大課題之一。動(dòng)脈血栓是造成90％以上的心肌梗死、80％腦卒中的主要原因，動(dòng)脈栓塞性心血管疾病一直是發(fā)達(dá)國家首位的死亡原因。血小板在血栓形成特別是動(dòng)脈血栓形成中起著重要作用。因此抗血小板治療是預(yù)防和治療血栓性疾病的重要措施。臨床廣泛使用的經(jīng)典抗栓藥物如第一代的阿司匹林，噻氯吡啶等，可相應(yīng)地抑制血小板活化過程中，由血栓烷A2(TXA2)和二磷酸腺苷(

2、ADP)介導(dǎo)的單一步驟，具有預(yù)防血栓形成的作用，第二代血栓性藥物是以阻斷血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa與纖維蛋白原(Fg)結(jié)合為主要機(jī)制。近年來針對(duì)動(dòng)脈血栓形成早期階段的研究，其中膠原-血管性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)-GPⅠb軸各分子間相互作用的分子機(jī)制及抗血栓治療新靶點(diǎn)的研究已成為血栓與止血領(lǐng)域中的熱點(diǎn)和前沿科學(xué)問題之一。由于針對(duì)膠原-vWF-GPⅠb軸來阻止血小板的早期

3、粘附和活化，具有更早、更好的抗栓活性，并減少出血危險(xiǎn)性，形成新一代的抗栓藥物，因此具有更為廣闊的應(yīng)用前景。趙益明等之前報(bào)道了一株特異性針對(duì)vWF-A3區(qū)的單克隆抗體（monoclonalantibody，mAb）SZ-123，該單抗不僅能抑制vWF與膠原的結(jié)合，還能抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集（血小板膜糖蛋白GPⅠb結(jié)合于vWF-A1區(qū)），這一結(jié)果提示vWF-A3區(qū)膠原結(jié)合部位可能動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)vWF-A1區(qū)的功能。此外，SZ-123抗體已

4、經(jīng)證實(shí)在猴體內(nèi)具有抗栓活性?？箆WF-A3區(qū)特異性單抗SZ-123不但能夠抑制vWF-A3區(qū)與膠原結(jié)合，而且抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集?，F(xiàn)己排除了SZ-123與vWF-A1區(qū)的作用，有假設(shè)提出是由于mAbS2-123與vWF-A3作用的同時(shí)影響了vWF-A1區(qū)的空間構(gòu)像，改變了其空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了vWF-A1區(qū)與血小板的結(jié)合，從而產(chǎn)生抗栓的作用。因此，制備分子量較小的單鏈抗體，更有利于從蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上解釋SZ-123的作用機(jī)制，

5、這也是制備S2-123單鏈抗體的重要意義所在。
　　 目的：
　　 本研究旨在利用基因工程手段制備相對(duì)于抗vWF-A3區(qū)特異性單抗SZ-123分子量較小的單鏈抗體，通過原核和真核表達(dá)以及體外生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是否具有與SZ-123相似的功能活性，從而從蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上解釋單抗SZ-123與vWF不同功能結(jié)構(gòu)域相互作用的獨(dú)特機(jī)制，為下一步鼠源單抗SZ-123的人源化和更深一步探討單抗SZ-123的抗栓機(jī)制提供理論依據(jù)，同

6、時(shí)也為將來開發(fā)基于單抗S2-123的抗栓藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 (1)首先用RT-PCR方法擴(kuò)增單抗SZ-123重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，并用Over-lapPCR方法將重鏈和輕鏈與linker序列拼接成單鏈抗體(SZ-123ScFv)，構(gòu)建S2-123ScFv原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，完成SZ-123ScFv的原核表達(dá)，對(duì)其濃縮，然后用ELISA，Westernblot等方法驗(yàn)證SZ-123ScFv的免疫原

7、性。
　　 (2)首先用RT-PCR方法擴(kuò)增單抗SZ-123重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，并用Over-lapPCR方法將重鏈和輕鏈與linker序列拼接成單鏈抗體(S2-123ScFv)，構(gòu)建單抗S2-123ScFv基因真核表達(dá)載體pSectag/SZ-123ScFv，經(jīng)轉(zhuǎn)染和篩選后，并在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中獲得表達(dá)，完成SZ-123ScFv的真核表達(dá)，對(duì)其濃縮，然后用SDS-PAGE，WestemBlot等方法驗(yàn)證SZ-12

8、3ScFv的免疫原性。
　　 (3)通過膠原結(jié)合抑制試驗(yàn)驗(yàn)證SZ-123單鏈抗體的功能活性：以人胎盤Ⅲ型膠原包板，加入vWF純品后，再加入原核與真核表達(dá)的濃縮純化后的蛋白孵育，最后加入辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記的兔抗人vWF多克隆抗體，四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色后，酶標(biāo)儀讀取吸光度值(OD)。
　　 (4)通過瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚

9、集實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SZ-123單鏈抗體的功能活性：抽取健康人檸檬酸鈉抗凝的靜脈血，分離得到富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。加入瑞斯托霉素誘導(dǎo)，在血小板聚集儀上檢測(cè)其抑制血小板聚集功能。
　　 結(jié)果：
　　 SZ-123ScFv的原核表達(dá)：VH、VL可變區(qū)基因符合小鼠抗體可變區(qū)特征，SZ-123ScFV基因拼接正確。表達(dá)產(chǎn)物除少量為分泌型外，主要以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體蛋白的20％。經(jīng)過變性和復(fù)性后，獲得具有

10、生物活性的單鏈抗體片段。其有一定的抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集功能(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 SZ-123ScFv的真核表達(dá)：將780bp拼接后的ScFv插入真核表達(dá)載體pSectag-123ScFv，經(jīng)DNA測(cè)序鑒定正確，成功構(gòu)建了pSectag/Sz-123ScFv，將pSectag/SZ-123ScFv轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細(xì)胞(ChineseHamsterOvary，CHO)后獲得目的蛋白表達(dá)，SDS-P

11、AGE和WesternBlot檢測(cè)表明目的蛋白分子量約為45kD。生物學(xué)功能試驗(yàn)結(jié)果顯示SZ-123ScFv能夠劑量依賴性抑制vWF與in型膠原的結(jié)合，且能抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集。與單抗SZ-123相比，其抑制作用有所降低。
　　 結(jié)論：
　　 (1)成功地構(gòu)建了SZ-123單鏈抗體基因原核表達(dá)載體pET20b(+)-123ScFv，導(dǎo)入大腸桿菌中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)完成了其原核的表達(dá)。該小分子抗體具有特異結(jié)合vWF-A

12、3區(qū)的能力。
　　 (2)成功地構(gòu)建了SZ-123單鏈抗體基因真核表達(dá)載體pSectagSZ-123ScFv，并轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞后，篩選出轉(zhuǎn)染成功的單克隆細(xì)胞，完成了其真核的表達(dá)。
　　 (3)原核表達(dá)的單鏈抗體有較弱的抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集功能。真核表達(dá)的單鏈抗體具有抑制膠原與vWF結(jié)合和抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集的功能，但與單抗SZ-123相比，其活性有所下降。
　　 (4)SZ-123單鏈抗體的