抗人CD80單鏈抗體(ScFv)及雙價(jià)抗體(diabody)的研制及生物學(xué)功能初步研究.pdf

1、CD80(也稱(chēng)B7-1)是B7家族重要的共刺激分子。人CD80分子編碼基因定位于人類(lèi)染色體3q13.3-q21區(qū)內(nèi)，含有1491bp。CD80是分子量約為44-54kD的I型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)在專(zhuān)職性抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)樹(shù)突狀細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞。CD80分子的配體為表達(dá)在T淋巴細(xì)胞表面的CD28和CTLA-4。CD80與CD28結(jié)合為T(mén)細(xì)胞的活化提供第二信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的

2、增殖與分化；而與CTLA-4結(jié)合介導(dǎo)抑制信號(hào)，從而下調(diào)或終止T細(xì)胞效應(yīng)。若缺乏此共刺激信號(hào)，抗原特異性的第一信號(hào)非但不能有效激活特異性T細(xì)胞，反而導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能，或者耐受。研究表明，CD80介導(dǎo)的信號(hào)通路不僅能調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化過(guò)程，而且還參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后狀況。
　　 單鏈抗體(single-chain variable fragment，ScFv)是一種小分子的抗體，含有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)，由重鏈可變區(qū)(the var

3、iable heavy chain，VH)和輕鏈可變區(qū)(the variable light chain，VL)通過(guò)一段連接肽連接而成，大小為26-28kDa。VH和VL之間的連接肽長(zhǎng)度為10-25個(gè)氨基酸，最為普遍的為(Gly4Ser)3十五肽。Diabody是單鏈抗體的二聚體形式，是通過(guò)將單鏈抗體VH和VL之間的連接肽縮短至3-10個(gè)氨基酸時(shí)，可促進(jìn)分子間VH和VL的配對(duì)而形成。
　　 第一部分抗人CD80單鏈抗體(ScFv

4、)的研制及生物學(xué)功能初步研究
　　 1.目的：構(gòu)建及表達(dá)抗人CDS0單鏈抗體(ScFv)，鑒定其抗原抗體結(jié)合活性，并初步研究其生物學(xué)功能。
　　 2.方法：采用RT-PCR法從分泌鼠抗人CD80 McAb的雜交瘤細(xì)胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重疊延伸拼接PCR方法構(gòu)建具有前導(dǎo)肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因，并克隆至pIRES2-EGFP表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，G418加壓

5、篩選。純化抗人CD80-ScFv，分析其效價(jià)，并鑒定其對(duì)膜型CD80的識(shí)別。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析抗人CD80-ScFv與相應(yīng)抗原的結(jié)合能力。MTT法體外分析抗人CD80-ScFv對(duì)Raji細(xì)胞體外增殖的抑制作用和對(duì)CD80介導(dǎo)的共刺激信號(hào)的阻斷作用。
　　 3.結(jié)果：構(gòu)建的抗人CD80-ScFv基因全長(zhǎng)為828bp，經(jīng)測(cè)序含有信號(hào)肽和連接肽編碼基因。實(shí)驗(yàn)獲得穩(wěn)定分泌細(xì)胞株(命名為SA-Ⅱ)。上清中抗體得率為15.12mg/L，相對(duì)效

6、價(jià)為2.0μg/5×105個(gè)細(xì)胞。該抗體與天然表達(dá)CD80分子的Raji和Daudi細(xì)胞陽(yáng)性結(jié)合率分別為96.6％和95.0％?？谷薈D80-ScFv對(duì)鼠源親本抗體4E5與抗原結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制率達(dá)98.67％，并能抑制Raji細(xì)胞的體外增殖，而且能阻斷CD80介導(dǎo)的共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制PBMC的增殖，增殖率下降43.48％。
　　 4.結(jié)論：成功構(gòu)建的表達(dá)抗人CD80-ScFv的細(xì)胞株，其分泌的抗體具有良好的生物學(xué)活性。該抗體的研

7、制在CD80及相關(guān)分子的基礎(chǔ)或/及臨床研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　 第二部分抗人CD80雙價(jià)抗體(diabody)的研制及生物學(xué)功能初步研究
　　 1.目的：構(gòu)建及表達(dá)抗人CD80雙價(jià)抗體(diabody)，并初步研究其生物學(xué)功能。
　　 2.方法：PCR法獲得輕重鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建表達(dá)載體pIRES2-EGFP/diabody。將pIRES2-EGFP/diabody轉(zhuǎn)染中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，G418

8、加壓，篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)并收集上清，經(jīng)鎳柱純化，并經(jīng)變性及非變性SDS-PAGE電泳對(duì)抗體分子的雙體性進(jìn)行鑒定。以鼠源性親本抗體4E5為對(duì)照，測(cè)定抗人CD80-diabody的效價(jià)。采用免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析抗體與細(xì)胞膜型CD80分子的結(jié)合活性及與鼠源性親本抗體4E5的競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng)；MTT法分析該抗體對(duì)天然高表達(dá)CD80的Raji細(xì)胞體外增殖的影響，同時(shí)分析其對(duì)CD80介導(dǎo)的共刺激信號(hào)阻斷作用的影響。
　　

9、 3.結(jié)果：成功構(gòu)建抗人CD80-diabody表達(dá)載體，基因全長(zhǎng)為798bp，含有信號(hào)肽和Gly4Ser連接肽編碼基因。獲得了穩(wěn)定分泌雙價(jià)抗體的細(xì)胞株(命名為SA-Ⅲ)，培養(yǎng)上清中純化抗體的得率為15mg/L，PAGE結(jié)果顯示其為一個(gè)二聚體，Mr約為53kDa(抗人CD80-ScFv Mr約為27kDa)。抗人CD80-diabody的效價(jià)為1.5μg/5×105個(gè)細(xì)胞，與L929-CD80、Raji及Daudi的陽(yáng)性結(jié)合率分別為9