抗人B7-1人-鼠嵌合抗體的制備及生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的：在本科室成功構(gòu)建的抗人B7-1人-鼠嵌合抗體重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES/ch-4E5的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，獲得持續(xù)穩(wěn)定分泌嵌合抗體的真核表達(dá)細(xì)胞株CHO-ch-4E5并制備嵌合抗體。進(jìn)而分析抗體的生物學(xué)功能。 方法：(1)采用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取抗人B7-1人-鼠嵌合抗體的重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES/ch-4E5，經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用G418選擇培養(yǎng)基加壓培養(yǎng)約2周，收集培養(yǎng)上清，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行檢測。

2、陽性孔細(xì)胞再經(jīng)亞克隆篩選；(2)收集穩(wěn)定分泌嵌合抗體的CHO細(xì)胞，采用Trizol法抽提總RNA，經(jīng)RT-PCR方法合成cDNA，再加入特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增嵌合重、輕鏈基因；(3)大規(guī)模無血清培養(yǎng)穩(wěn)定分泌嵌合抗體的CHO細(xì)胞，收集上清，經(jīng)高速離心、超濾濃縮及PBS透析過夜，采用Protein G親和層析柱進(jìn)行分離純化，Lowry法定量，間接免疫熒光及FCM法分析抗體對(duì)Raii、Daudi、U937、K562、L929-B7-1及Jur

3、kat等多種細(xì)胞表面膜型B7-1分子的結(jié)合；(4)將Raji和Daudi細(xì)胞與終濃度為10μg/ml的ch-4E5共培養(yǎng)，經(jīng)FCM動(dòng)態(tài)檢測腫瘤細(xì)胞表面Fas及FasL的表達(dá)，MTT法分析ch-4E5對(duì)Raji和Daudi細(xì)胞體外增殖的抑制作用；(5)針對(duì)嵌合抗體的Fc段功能，以人外周血PBMC為效應(yīng)細(xì)胞，以上述腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，按效靶比20:1混合細(xì)胞，加入終濃度10μg/ml的ch-4E5共培養(yǎng)，MTT法分析嵌合抗體介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)

4、；(6)在上述體外研究的基礎(chǔ)上，選取4～6周齡，雌性BALB/c裸鼠，隨機(jī)分組，10只/組。按體重10 mg/kg的抗體量分別將抗體(ch-4E5、親本4E5)與Raji細(xì)胞(5×106/只)混合于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，按下列組別接種于裸鼠左前肢腋下。①組：Raji；②組：Raji+Hu-IgG1；③組：Raji+ch-4E5；④組：Raji+4E5。逐日觀察并記錄荷瘤裸鼠的生存狀況、成瘤時(shí)間及成瘤率。 結(jié)

5、果：(1)成功獲得了持續(xù)穩(wěn)定分泌抗人B7-1人-鼠嵌合抗體的真核表達(dá)細(xì)胞株CHO-ch-4E5，PCR鑒定結(jié)果證實(shí)目的基因正確；(2)經(jīng)Lowry法定量，從CHO-ch-4E5培養(yǎng)上清中獲取嵌合抗體的量約30mg/L；(3)FCM分析表明，ch-4E5能夠特異性結(jié)合多種細(xì)胞表面膜型B7-1分子，與Raji、Daudi、U937、K562、L929-B7-1及Jurkat細(xì)胞的陽性結(jié)合率分別為98.6％、96.4％、2.2％、29.6％、

6、98.8％及10.1％，與親本鼠源性抗體的結(jié)合率相當(dāng)；(4)ch-4E5與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，能夠明顯抑制Raji及Daudi細(xì)胞的體外增殖，抑制率分別為34.60％及32.64％，進(jìn)一步的分析表明腫瘤細(xì)胞Fas及FasL的表達(dá)上調(diào)；(5)ch-4E5 Fc段介導(dǎo)PBMC對(duì)Raji及Daudi的殺傷率分別為55.61％及54.42％；(6)體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，Raji細(xì)胞經(jīng)ch-4E5及4E5抗體處理的實(shí)驗(yàn)組均未見腫瘤形成，小鼠成活率