B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究.pdf

1、B7-1（又稱CD80）是主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)表面的重要共刺激分子。B7-1與相應(yīng)的受體CD28結(jié)合，介導(dǎo)的共刺激信號(hào)，是T、B細(xì)胞活化、增殖、分化進(jìn)而發(fā)揮免疫效應(yīng)所必需的。缺乏該信號(hào)，T細(xì)胞將進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)（Anergy）或免疫耐受（Tolerance），甚至程序性死亡（Apoptosis）。
　　自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）是自身反

2、應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞過度活化，導(dǎo)致大量自身抗體生成，進(jìn)而累及多系統(tǒng)、多器官的一類嚴(yán)重疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是其典型代表。B7/CD28信號(hào)通路的過度活化與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，已有文獻(xiàn)報(bào)道B7-1和B7-2單克隆抗體可有效減少SLE模型小鼠免疫細(xì)胞的活化，自身抗體的生成，逆轉(zhuǎn)SLE的腎臟病理?yè)p傷。
　　嵌合抗體（chimeric antibody）是由鼠源性抗

3、體的可變區(qū)基因與人源性抗體的恒定區(qū)基因拼接而成的嵌合基因，插入載體后轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表達(dá)的抗體分子。因其減少了鼠源成分，從而降低了人抗鼠抗體反應(yīng)(human anti-murine-antibody response，HAMA)的發(fā)生，成為了新的研究熱點(diǎn)。
　　本課題在建立和人紅斑狼瘡類似的慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，運(yùn)

4、用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)該疾病模型進(jìn)行干預(yù)。通過免疫學(xué)、血清學(xué)及腎臟組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)嵌合抗體對(duì)疾病模型的免疫干預(yù)效應(yīng)，同時(shí)為該類疾病尋找新的高效、特異、低毒的免疫干預(yù)手段。
　　一、B7-1人-鼠嵌合抗體的制備及鑒定
　　目的：制備B7-1人-鼠嵌合抗體并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　方法：采用細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)法制備嵌合抗體；Protein G免疫親和層析法分離純化抗體；流式細(xì)胞術(shù)分析嵌合抗體對(duì)人及小

5、鼠細(xì)胞膜型B7-1分子抗原表位的識(shí)別。
　　結(jié)果：經(jīng)Protein G親和層析柱分離純化，細(xì)胞培養(yǎng)上清中嵌合抗體蛋白的得率約為25mg/L；B7-1嵌合抗體與L929-B7-1、Daudi以及小鼠脾臟細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率分別為94.2％、93.8%及65.4%。
　　結(jié)論：本研究所用B7-1人-鼠嵌合抗體既能識(shí)別人的B7-1分子抗原表位又能識(shí)別鼠的B7-1分子抗原表位。
　　二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及

6、生物學(xué)鑒定
　　目的：構(gòu)建cGVHD小鼠狼瘡樣腎炎模型，并通過免疫學(xué)、血清學(xué)和組織形態(tài)學(xué)對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。
　　方法：將30只6~8周齡雌性( C57BL/6×BALB/ c)BCF1小鼠隨機(jī)分為2組，模型組于0、3、7和11d經(jīng)眼眶靜脈注射親代BALB/c小鼠脾臟淋巴細(xì)胞107/100μL/只。對(duì)照組給予等體積生理鹽水。末次注射后第7天，雙色免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活化情況；每2周定期檢測(cè)小鼠血清中抗ds

7、DNA抗體及ANA含量；每4周試紙法定期檢測(cè)尿蛋白含量。實(shí)驗(yàn)的第12周處死所有小鼠，取腎臟HE染色觀察腎臟組織病理改變，直接免疫熒光法檢測(cè)免疫復(fù)合物（IC）的沉積情況及透射電鏡法觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果：模型組小鼠脾臟細(xì)胞抗原遞呈細(xì)胞（MHCⅡ+細(xì)胞）膜型CD11b+，CD11c+和Gr1+的比例較對(duì)照組明顯上升（P<0.05），抗體形成細(xì)胞（B220+）上B細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD21和CD23及共刺激分子CD80和CD

8、86的表達(dá)明顯上升（P<0.05），同時(shí)T細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD4、CD8a、CD25、CD28和CD152表達(dá)也明顯上升（P<0.05）；12周時(shí)，100%的模型組小鼠出現(xiàn)蛋白尿；4周時(shí)，血清中抗dsDNA抗體和ANA陽(yáng)性率分別為50%和90%；HE染色鏡下觀察,模型組腎小球腫脹，有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及新月體生成；直接免疫熒光法可見腎小球血管襻有大量IC沉積；透射電鏡下可見模型組小鼠腎基底膜節(jié)段性增厚，大量電子致密物沉積。
　　結(jié)論：本

9、研究成功建立可靠的cGVHD小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　三、B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究
　　目的：運(yùn)用B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)狼瘡樣腎炎模型小鼠的進(jìn)行免疫干預(yù)效應(yīng)并探討其分子機(jī)制。
　　方法：按第二部分建模方法建模，取BCF1代小鼠隨機(jī)分為抗體干預(yù)組、CTX干預(yù)組和模型組。抗體干預(yù)組在末次注射淋巴細(xì)胞后第1、3、5、8、15、30及60d分別經(jīng)眼眶靜脈注射B7-1嵌合抗體(克隆號(hào)

10、2B11)200μg/100μL/只，CTX干預(yù)組在末次注射淋巴細(xì)胞后第1、3、5、8、15天分別腹腔注射CTX2.5mg/100μL/只。按照上述時(shí)間點(diǎn)取材分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活化情況，抗dsDNA抗體、ANA及尿蛋白含量，觀察腎臟組織HE染色，免疫復(fù)合物（IC）沉積，腎小球超微結(jié)構(gòu)改變等情況。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，抗體干預(yù)組小鼠脾臟抗原遞呈細(xì)胞（MHCⅡ+細(xì)胞）膜型CD11b+，CD11c+和Gr1+的比例較模型組明

11、顯降低（P<0.05），抗體形成細(xì)胞（B220+）上B細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD21和CD23以及共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)明顯降低（P<0.05），同時(shí)T細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD25、CD28和CD152表達(dá)也明顯降低（P<0.05）；12周時(shí)，模型組小鼠血清抗dsDNA抗體陽(yáng)性率為50%，而抗體干預(yù)組未檢出，模型組ANA的陽(yáng)性率為90%，抗體干預(yù)組為40%，且熒光面積和熒光亮度均下降；12周時(shí)，模型組100%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含

12、量為（++~++++），而抗體干預(yù)組12周時(shí)僅有30%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含量為（+~++）；HE染色鏡下觀察,模型組腎小球腫脹，有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及新月體生成，而抗體干預(yù)組僅有部分出現(xiàn)腎小球體積輕度增大，腎小球囊腔厚薄略微不均一，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；直接免疫熒光法可見模型組腎小球血管襻有大量IC沉積，抗體干預(yù)組的腎小球部位也可見少量熒光，熒光面積和熒光亮度都弱于模型組；透射電鏡下可見模型組小鼠腎基底膜節(jié)段性增厚，大量電子致密物沉積，而