人鼠嵌合B7-2抗體對狼瘡樣腎病模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機制研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是以產(chǎn)生多種自身抗體，全身多系統(tǒng)、多器官受累為特征的自身免疫性疾病，狼瘡樣腎?。╨upus nephritis，LN）是該疾病最嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前，該疾病的發(fā)病機制尚無明確定論，可能與環(huán)境、遺傳等多種因素有關(guān)。
　　B7-2分子是表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）表面重要的共刺激分子，B7-2分子通過與T細(xì)胞

2、表面的CD28分子結(jié)合，可產(chǎn)生促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖、分化以及發(fā)揮免疫效應(yīng)所必需的共刺激信號。此信號的缺乏可導(dǎo)致T細(xì)胞進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)（Anergy）或者免疫耐受（Tolerance），甚至引起細(xì)胞程序性死亡（Apoptosis）。研究表明，B7-CD28共刺激信號通路在SLE的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。因此，應(yīng)用特異性B7抗體阻斷或削弱該信號通路，可抑制自身免疫應(yīng)答，減輕SLE的病理損傷，為治療此類疾病提供了高效、特異的生物治療方法。

3、>　　傳統(tǒng)鼠源性抗體因其免疫原性，應(yīng)用于人體易產(chǎn)生人鼠抗體反應(yīng)（Human anti-mouse antibody，HAMA)，影響治療效果。采用基因工程技術(shù)設(shè)計出的人鼠嵌合抗體，保留了鼠源抗體特異性和親和力，大大降低抗體免疫原性，避免 HAMA反應(yīng)，同時具有介導(dǎo)ADCC效應(yīng)、CDC效應(yīng)及免疫調(diào)理作用。
　　本課題通過建立與人類SLE疾病類似的慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）小鼠狼瘡樣腎病模型，應(yīng)用自行研制的人鼠嵌合B7-2抗體對

4、該疾病模型進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而從免疫學(xué)、血清學(xué)及腎臟組織形態(tài)學(xué)等方面觀察抗體對疾病模型病理損傷的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)及其分子機制。
　　一、人鼠嵌合B7-2抗體制備及鑒定
　　目的：制備人鼠嵌合B7-2抗體并鑒定其生物學(xué)活性。方法：復(fù)蘇本科室保存的穩(wěn)定分泌人鼠嵌合B7-2抗體的細(xì)胞株4F4，采用細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、超濾濃縮及免疫親和層析等技術(shù)制備人鼠嵌合B7-2抗體；流式細(xì)胞術(shù)分析人鼠嵌合B7-2抗體對不同細(xì)胞膜型B7-2分子的識別。結(jié)果：4F4

5、細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體得率約為4mg/L，人鼠嵌合B7-2抗體與L929-B7-2、Daudi以及小鼠脾臟細(xì)胞的陽性結(jié)合率分別為99.0％，93.7%和63.0%。結(jié)論：人鼠嵌合B7-2抗體能夠特異性識別不同細(xì)胞膜型B7-2分子。
　　二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎病模型的建立及生物學(xué)鑒定
　　目的：構(gòu)建慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）小鼠狼瘡樣腎病模型并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法：將20只6~8周齡雌性（C57BL/J6×

6、BALB/c）F1雌鼠隨機分成兩組，造模組小鼠于0、3、7和11d經(jīng)尾靜脈注射親代雌性BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞，107/100μL/只。對照組應(yīng)用同體積生理鹽水處理。末次注射后第七天，流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞（MHC-II+）與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞（B220+）的活化程度；每2周定期檢測血清中抗雙鏈dsDNA抗體、ANA的含量；每月定期采集晨尿檢測尿蛋白含量。3個月后處死小鼠，經(jīng) HE染色觀察腎臟病理變化，直接免疫熒光法分析免疫

7、復(fù)合物（IC）的沉積，透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：造模組小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞（MHC-II+）與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞（B220+）的活化程度明顯增強（p<0.05）；建模第2周，造模組80%的小鼠血清中可檢測到抗dsDNA抗體和ANA，第4周時達(dá)到90%；建模3個月，造模組80%的小鼠可檢測出蛋白尿，蛋白含量為++~++++；HE染色觀察顯示，造模組小鼠出現(xiàn)腎小球腫脹及炎性細(xì)胞浸潤；直接免疫熒光法顯示，造模組小鼠腎小球部位有大

8、量IC沉積；造模組小鼠透射電鏡下可見腎小球致密物沉積、基底膜節(jié)段性增厚等病理改變。結(jié)論：慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎病模型構(gòu)建成功。
　　三、人鼠嵌合B7-2抗體對小鼠狼瘡樣腎病模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機制的研究
　　目的：探討人鼠嵌合B7-2抗體通過阻斷B7/CD28信號通路對小鼠狼瘡樣腎病模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及其分子機制。方法：按上述建模方法，將40只F1代雌鼠隨機分為4組，即造模組、抗體干預(yù)組、CTX組及對照組。末次淋

9、巴細(xì)胞注射后，干預(yù)組小鼠于第1、3、5、8及15天經(jīng)尾靜脈注射人鼠嵌合B7-2抗體，200μg/只，之后每隔1個月注射一次，連續(xù)注射3個月；CTX組于第1、2天腹腔注射CTX2.5mg/只。流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞（MHC-II+）與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞（B220+）的活化程度；每2周定期檢測血清中抗雙鏈dsDNA抗體、ANA的含量；每月定期采集晨尿檢測尿蛋白含量。3個月后處死小鼠，經(jīng) HE染色觀察腎臟病理變化，直接免疫熒光法分

10、析免疫復(fù)合物（IC）的沉積，透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，抗體干預(yù)組小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞（MHC-II+）與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞（B220+）的活化程度明顯低于造模組（p<0.05）；造模第4周時，造模組90%的小鼠血清能檢測到抗dsDNA抗體和ANA的表達(dá)，而抗體干預(yù)組的檢出率僅為30%，且抗體滴度明顯低于造模組；造模第3個月時70%的造模組小鼠出現(xiàn)蛋白尿，蛋白含量為++~++++，抗體干預(yù)組

11、僅有20%，且蛋白含量為+~++； HE染色觀察顯示，造模組腎臟組織出現(xiàn)腎小球腫脹，炎性細(xì)胞浸潤等癥狀，抗體干預(yù)組小鼠腎小球體積輕微增大，周圍少許炎性細(xì)胞浸潤，小鼠腎臟病理學(xué)改變明顯輕于造模組；直接免疫熒光法發(fā)現(xiàn)造模組小鼠腎小球部位有大量IC沉積，抗體干預(yù)組的腎小球輪廓較清晰，IC的沉積明顯少于造模組；通過透射電鏡對超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)造模組出現(xiàn)致密物沉積、基底膜節(jié)段性增厚等病理改變，抗體干預(yù)組未出現(xiàn)明顯病理改變。CTX組小鼠上述指標(biāo)與